貴州黑山羊GnRHR基因與繁殖性狀相關(guān)性的研究

張勁松 龍威海 許厚強(qiáng) 馮文武 陳祥*

（1，貴州省習(xí)水縣農(nóng)牧局 564600；2，貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 550025）

貴州黑山羊GnRHR基因與繁殖性狀相關(guān)性的研究

張勁松1龍威海2許厚強(qiáng)2馮文武2陳祥2*

（1，貴州省習(xí)水縣農(nóng)牧局 564600；2，貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 550025）

研究GnRHR基因SNP與貴州黑山羊繁殖性狀關(guān)聯(lián)性。試驗(yàn)采用PCR-SSCP技術(shù)檢測(cè)GnRHR基因單核苷酸多態(tài)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，貴州黑山羊GnRHR基因外顯子1檢測(cè)到1個(gè)SNP位點(diǎn)G121A?；蛐团c繁殖性狀關(guān)聯(lián)分析顯示，貴州黑山羊GnRHR基因AA基因型個(gè)體產(chǎn)羔數(shù)顯著高于與AG和GG基因型個(gè)體（P＜0.05）。結(jié)果提示：GnRHR基因可能是影響山羊產(chǎn)羔數(shù)的主效基因。

GnRHR；基因；遺傳；繁殖性狀；貴州黑山羊

促性腺激素釋放激素受體（Gonadotropin releasing hormone receptor，GnRHR）是垂體促性腺細(xì)胞合成的一種高親和G蛋白偶聯(lián)受體，在垂體促性腺細(xì)胞表面與促性腺激素釋放激素的結(jié)合，從而促進(jìn)促卵泡素和促黃體素的合成和釋放，對(duì)動(dòng)物機(jī)體的繁殖進(jìn)行調(diào)控。近年來(lái)，把GnRHR基因作為影響動(dòng)物繁殖性能的候選基因來(lái)研究，取得了一系列研究成果。黃楊河[1]等采用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)GnRHR基因在川東白山羊、貴州白山羊和古藺馬羊進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)一處堿基突變，且多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)。國(guó)內(nèi)外對(duì)動(dòng)物和人的GnRHR基因已有報(bào)道，但對(duì)于貴州黑山羊GnRHR基因多態(tài)性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)采用PCR-SSCP及PCR產(chǎn)物直接測(cè)序技術(shù)對(duì)GnRHR基因在貴州黑山羊的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，以探尋GnRHR基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)之間的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究貴州黑山羊繁殖性狀的遺傳機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)均采集具有前3胎產(chǎn)羔記錄的貴州黑山羊102只采自貴州省黔西縣。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒，聚丙烯酰胺凝膠， 瓊脂糖凝膠， 2xEs Taq Master Mix， DM2000，Buffer1xTBE緩沖液均購(gòu)自貴州鼎國(guó)生物工程有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中綿羊GnRHR(登錄號(hào)：BC120472)基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。利用Primier-BLAST在線軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物信息見(jiàn)表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 SSCP分型及測(cè)序

PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 3min；34個(gè)循環(huán)（95℃ 30s，表1溫度30s，72℃ 30min）；72℃延伸5min；4℃保存。PCR反應(yīng)體系為 20μL： 2×Taq PCR Master Mix 10μL， DNA 模板 2μL，上、下游引物各1.5μL，加水至20μL。SSCP所需PCR產(chǎn)物用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。取5μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。取7μL的PCR產(chǎn)物和7μL的變性劑，100℃水浴10分鐘后置于-20℃冰箱中20min。點(diǎn)樣完成后先進(jìn)行250V電壓預(yù)電泳30min，后110V電壓進(jìn)行16h左右電泳，最后經(jīng)固定、銀染、顯色后進(jìn)行分辨條帶帶型。選擇條帶單一的PCR產(chǎn)物送交北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。用DNAStar軟件對(duì)序列結(jié)果進(jìn)行校正，BLAST分析確定SNPs。

表1 引物相關(guān)信息

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-SSCP分型及測(cè)序

在貴州黑山羊GnRHR-T引物所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行SSCP分析，結(jié)果顯示擴(kuò)增序列在貴州黑山羊樣品中均出現(xiàn)3種帶型，純合型定義為AA型和GG型，雜合型定義為AG 型 (圖 1)。

圖1 PCR-SSCP電泳圖譜

選擇貴州黑山羊不同基因型個(gè)體PCR產(chǎn)物送交公司測(cè)序，通過(guò)SepMan程序分析測(cè)序結(jié)果并比對(duì)，在GnRHR基因第1外顯子121bp發(fā)生突變，突變前后均未引起氨基酸的改變。

圖2 多態(tài)位點(diǎn)測(cè)序峰圖

2.2 GnRHR基因SNP位點(diǎn)群體遺傳變異分析

對(duì)G121A進(jìn)行遺傳參數(shù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表2。由表可知：貴州黑山羊以AG基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，基因型頻率為0.480。優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)镚，其頻率為0.603。貴州黑山羊群體表現(xiàn)為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5）。

表2 G121A位點(diǎn)遺傳參數(shù)

2.3 GnRHR基因多態(tài)性與繁殖性狀關(guān)聯(lián)性分析

由表3可知，在貴州黑山羊試驗(yàn)群體中，AA基因型與AG和GG基因型差異顯著（P＜0.05），而AG基因型與GG基因型差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

GnRHR數(shù)量的增加能引起LH的高峰，而動(dòng)物的排卵主要依靠LH高峰。因此，GnRHR基因?qū)?dòng)物的繁殖性能起著重要的作用。垂體GnRHR濃度的升高能促進(jìn)哺乳動(dòng)物的排卵，而GnRHR的缺失則引起排卵障礙，進(jìn)而導(dǎo)致不育。近幾年來(lái)，對(duì)GnRHR基因與繁殖性能的關(guān)系展開(kāi)大量研究。Dun[2]等對(duì)母雞群體GnRHR基因檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GnRHR基因?qū)δ鸽u產(chǎn)產(chǎn)蛋數(shù)和雙黃蛋分別具有顯性效應(yīng)和加性效應(yīng)；柳楠[3]等檢測(cè)了GnRHR基因在嶗山奶山羊的單核苷酸多態(tài)性，結(jié)果顯示該基因A261G突變，對(duì)于經(jīng)產(chǎn)母羊GA型產(chǎn)羔數(shù)顯著高于AA型；張育軍[4]等檢測(cè)了GnRHR基因外顯1和外顯子2的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)外顯子2內(nèi)的突變對(duì)于黃淮山羊產(chǎn)羔數(shù)BB型比AA型多0.66只，差異顯著；朱廣琴[5]等研究發(fā)現(xiàn)GnRHR基因外顯子1存在G→A的突變，在黃淮山羊AA型產(chǎn)羔數(shù)高于AG型產(chǎn)羔數(shù)；黃楊河[1]等對(duì)波爾山羊及其他9個(gè)地方山羊品種GnRHR基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)突變位點(diǎn)與本研究的G121A突變位點(diǎn)相同，并且在貴州黑山羊兩個(gè)群體中AA基因型個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)都顯著高于GG和GA基因型。綜上所述，GnRHR基因?qū)τ绊戀F州黑山羊產(chǎn)羔數(shù)有一定的影響，可能是影響其產(chǎn)羔性狀的候選基因。

表3 G121A位點(diǎn)不同基因型與不同山羊品種與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)分析

[1] 黃楊河,王憑青,楊力,儲(chǔ)明星,張寶云,鄧臘梅,譚穎,樊奇.促性腺激素釋放激素受體(GnRHR)基因多態(tài)性及其與山羊產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2012(1):22-28.

[2]Dunn I C,Miao Y W,Morris A,et al.A study of association between genetic markers in candidate genes and reproductive traits in one generation of a commercial broiler breeder hen population[J].Heredity,2004,92(2):128-134.

[3]柳楠,馬曉麗,程明,等.GnRHR基因多態(tài)性與嶗山奶山羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2014,29(6):78-83.

[4]張育軍,胡敏蘭,張子軍,丁建平,任春環(huán),楊玉敏,阮崇美.山羊GnRHR基因部分序列多態(tài)性及其與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)性分析[J].中國(guó)草食動(dòng)物,2010(4):13-16.

[5]朱廣琴,王慶林,康永剛,等.GnRHR,GDF9,KISS1基因多態(tài)性與黃淮山羊產(chǎn)羔性狀相關(guān)性的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2013(11):18.

貴州省科技重大專項(xiàng) [黔科合重大專項(xiàng)字 (2013)6008]。

張勁松（1973-），男，貴州省習(xí)水縣人，研究生，主要從事畜牧水產(chǎn)技術(shù)推廣。

*通訊作者：陳祥 (1974-)，博士，教授，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究。