RP—HPLC法測(cè)定扁枝槲寄生中齊墩果酸的含量

王曉蓉??孫歡??劉勝蘭??胡剛??秦雪

[摘要] 目的 建立測(cè)定扁枝槲寄生中齊墩果酸的RP-HPLC法。 方法 采用反相高效液相色譜法：Sepax Sapphire C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；柱溫17℃，流動(dòng)相為乙腈-甲醇-0.05%醋酸銨（69∶12∶21），流速0.9mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm。 結(jié)果 齊墩果酸在1.2～2.4μg范圍內(nèi)與峰面積成良好線性關(guān)系（R2=0.9992），回收率為97.6%。 結(jié)論 本方法操作簡(jiǎn)便，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于扁枝槲寄生藥材及飲片的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 扁枝槲寄生；齊墩果酸；RP-HPLC

[中圖分類號(hào)] R284 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2015）17-51-03

RP-HPLC determination of oleanolic acid in viscum articulatum

WANG Xiaorong SUN Huan LIU Shenglan HU Gang QIN Xue

Panzhihua Institute for Food and Drug Control， Panzhihua， Sichuan， Panzhihua 617000， China

[Abstract] Objective To establish a determination method of oleanolic acid in Viscum articulatum by RP-HPLC. Methods The determination was carried out by RP-HPLC： The analytical column was Sepax Sapphire C18 （250mm×4.6mm， 5μm） and the column temperature was 17℃， it applied with acetonitrile-methyl alcohol-0.05% ammonium acetate （69∶12∶21） as the mobile phase， the flow rate was 0.9 mL/min， the UV detection wave length was 210nm. Results Oleanolic acid showed a good linearity in range of 1.2-2.4μg （R2=0.9992）， the average recovery was 97.6%. Conclusion The method is simple， the result is accurate and has a good reproducibility， it can be used to quality control of viscum articulatum.

[Key words] Viscum articulatum； Oleanolic acid； RP-HPLC

桑寄生科槲寄生屬植物扁枝槲寄生Viscum articulatum Burm.f.，收載于《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[1]，其味苦，平，常用于祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎，與收載于《中國(guó)藥典》的同屬植物槲寄生具有同等功效[2]。目前關(guān)于它的化學(xué)成分研究較少，已見(jiàn)報(bào)道的有：黃酮類、三萜類及醇胺類等化合物[3-6]。有文獻(xiàn)通過(guò)探究中藥材中齊墩果酸與熊果酸的質(zhì)控指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，很多以前認(rèn)為僅含齊墩果酸或熊果酸一種成分的藥材，經(jīng)再研究證實(shí)實(shí)為同時(shí)含有齊墩果酸和熊果酸兩種成分[7-8]，鑒于扁枝槲寄生的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是采用薄層掃描法測(cè)定齊墩果酸的含量來(lái)評(píng)價(jià)，而至今尚無(wú)文獻(xiàn)對(duì)其是否還含有熊果酸進(jìn)行研究報(bào)道，且筆者按其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行薄層鑒別，發(fā)現(xiàn)此實(shí)驗(yàn)條件下無(wú)法分離齊墩果酸與熊果酸這一對(duì)性質(zhì)相近的同分異構(gòu)體，不能驗(yàn)證用薄層掃描法的斑點(diǎn)究竟是齊墩果酸的的單一組分還是與熊果酸的混合物，這直接影響了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性與可信度。故本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)建立RP-HPLC法對(duì)扁枝槲寄生中齊墩果酸含量的測(cè)定，以期更準(zhǔn)確、全面、客觀的評(píng)價(jià)扁枝槲寄生的質(zhì)量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

waters 2695-2489高效液相色譜儀；XS205型電子天平。

1.2 試藥、試劑

扁枝槲寄生：購(gòu)自四川御鼎堂中藥飲片有限公司。

對(duì)照品：齊墩果酸對(duì)照品（中國(guó)食品生物制品鑒定所，批號(hào)：110709-200505）、熊果酸對(duì)照品（中國(guó)食品生物制品鑒定所，批號(hào)：110742-200314）。

試劑：甲醇、乙腈為色譜純，其他均為分析純；水為雙蒸水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱：sapphire C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-0.05%醋酸銨（69∶12∶21）；流速：0.9mL/min；柱溫：17℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別取齊墩果酸、熊果酸對(duì)照品適量，精密稱定，置同一容量瓶中，加甲醇制成分別含0.15mg/mL

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

樣品號(hào) 稱樣量（g） 齊墩果酸 熊果酸

加標(biāo)量（mg） 回收率（%） RSD（%） 加標(biāo)量（mg） 回收率（%） RSD（%）

1 1.0122 3.0124 97.23 0.73 2.0098 96.03 0.95

3.1118 98.16 2.1011 97.68

2 1.0458 2.9984 97.69 2.0346 97.23

3.0031 98.54 2.0755 96.17

3 0.9987 3.0752 96.39 1.9973 95.38

2.9876 97.07 2.1102 96.29

4 1.0264 3.0227 98.41 2.0458 96.72

3.1088 97.93 2.1215 95.04

5 1.0735 3.0450 97.52 2.0216 97.81

3.0663 96.77 2.0073 96.17

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

樣品號(hào) 稱樣量（g） 齊墩果酸 熊果酸

峰面積值 含量（%） RSD（%） 峰面積值 含量（%） RSD（%）

1 1.0122 1251858 0.601 1.31 / / /

1267175 0.609 / /

2 1.0458 1283653 0.597 / / /

1279874 0.595 / /

3 0.9987 1243668 0.605 / / /

1259211 0.609 / /

4 1.0264 1253893 0.594 / / /

1270770 0.602 / /

5 1.0735 1293756 0.586 / / /

1301183 0.589 / /

齊墩果酸、0.1mg/mL熊果酸的混合溶液，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取扁枝槲寄生藥材，粉碎過(guò)四號(hào)篩，再取藥材粉約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25mL甲醇，密塞，稱定重量，超聲處理30min，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，過(guò)0.45μm濾膜，即得。

2.4 測(cè)定方法及含量計(jì)算

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液及供試品溶液10μL，按上述色譜條件進(jìn)樣，按峰面積一點(diǎn)歸依法計(jì)算含量。

3 實(shí)驗(yàn)方法的驗(yàn)證與結(jié)果

3.1 線性關(guān)系試驗(yàn)

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液8、10、12、14、16?L，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積積分為縱坐標(biāo)Y，含量為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得其線性回歸方程與相關(guān)系數(shù)。齊墩果酸進(jìn)樣量在1.2～2.4μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.9992），回歸方程為：Y=542232X-17784；熊果酸進(jìn)樣量在0.8～1.6μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.9995），回歸方程為：Y=481249X-24189。

3.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取上述混合對(duì)照品溶液10μL，按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得齊墩果酸、熊果酸的峰面積值間的RSD分別為1.03%、1.27%，均≤3%。可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)精密度良好，結(jié)果可靠。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取上述混合對(duì)照品溶液10μL，于上述色譜條件下，分別在0、4、8、12、24h后進(jìn)樣，測(cè)得齊墩果酸、熊果酸的峰面積值間的RSD分別為1.39%、1.58%，均≤3%?？梢?jiàn)混合對(duì)照品溶液在配制后24h內(nèi)基本穩(wěn)定，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠。

3.4 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已知含量的扁枝槲寄生粉末1g，分別加入齊墩果酸、熊果酸對(duì)照品適量，按2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法平行制備5份。測(cè)定峰面積，外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量，得出樣品回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，該實(shí)驗(yàn)方法回收率較高，達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，方法可靠。

3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

按2.3項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液5份，按上述色譜條件分別進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積并計(jì)算含量與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知：實(shí)驗(yàn)方法重現(xiàn)性良好，采用此方法考察扁枝槲寄生中齊墩果酸的含量可靠。

3.6 方法討論

齊墩果酸與熊果酸同為五環(huán)三萜類化合物，僅E環(huán)上一個(gè)甲基的位置不同，性質(zhì)極為相近，在中性流動(dòng)相中均可解離，但很難分離，且柱溫越高分離效果越差，筆者查閱文獻(xiàn)[2，9-12]并經(jīng)多次試驗(yàn)，最終選擇乙腈-甲醇-0.05%醋酸銨（69∶12∶21）為流動(dòng)相，柱溫17℃。藥材中齊墩果酸或熊果酸的提取方法常采用低極性溶劑直接提取或酸水解后再提取[7]，本實(shí)驗(yàn)用甲醇作為低極性溶劑考察了這兩種方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇超聲直接提取后雖然雜質(zhì)峰較多但不干擾實(shí)驗(yàn)，且提取更充分，故樣品的處理采用了甲醇直接超聲提取；在檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇上，通過(guò)分別對(duì)齊墩果酸和熊果酸對(duì)照溶液于200～400nm波段進(jìn)行波普掃描，最終實(shí)驗(yàn)選取210nm作為特征波長(zhǎng)，這也與文獻(xiàn)中大多采用205～220nm波段相一致[9-11]；在上述實(shí)驗(yàn)條件下，齊墩果酸與熊果酸能被檢測(cè)出較強(qiáng)的吸收峰且峰型較好，分離度較高（R≥1.5），滿足實(shí)驗(yàn)要求，見(jiàn)圖1。

A

B

A：混合對(duì)照品；B：供試品

圖1 RP-HPLC色譜圖

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)建立的RP-HPLC法測(cè)定扁枝槲寄生中齊墩果酸含量的方法，采用齊墩果酸與熊果酸作雙對(duì)照品，使測(cè)定結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠，由表2和圖1可知：扁枝槲寄生中未檢出熊果酸，這可能與該成分的含量太低或樣品處理有關(guān)。按照《四川省中藥材》[1]中扁枝槲寄生的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究對(duì)同一批扁枝槲寄生藥材進(jìn)行齊墩果酸的薄層掃描含量測(cè)定，測(cè)得結(jié)果為0.417%，與本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果有所差距，分析原因，這可能與薄層掃描法中為了排除雜質(zhì)斑點(diǎn)的干擾而進(jìn)行的諸如萃取、過(guò)柱洗脫等復(fù)雜的純化手段使待測(cè)物質(zhì)流失有關(guān)，且還受薄層板、顯色等諸多因素的影響。本實(shí)驗(yàn)方法不僅靈敏度、重現(xiàn)性與準(zhǔn)確度大大高于薄層掃描法，且樣品處理過(guò)程簡(jiǎn)單，提取更充分，為扁枝槲寄生的質(zhì)量控制提供了更可靠有效的方法保證與科學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2015-04-07）