三氮唑類抗真菌藥物的合成及其生物活性檢測(cè)

張崢++張建峰++謝小強(qiáng)

摘 要：為了探討三氮唑類抗真菌藥物的合成方法和生物活性檢測(cè)，將間二氟苯作為原料，采用傅里德-克拉夫茨反應(yīng)（下簡(jiǎn)稱“傅-克反應(yīng)”）合成中間體物質(zhì)，再經(jīng)過(guò)縮合、亞甲基轉(zhuǎn)移、開環(huán)等合成反應(yīng)制得氟康唑。選擇白色念珠菌和黑曲霉作為抑菌活性檢驗(yàn)參照物，利用PDA培養(yǎng)法培養(yǎng)兩種真菌，接種合成氟康唑，并記錄抑菌活性。根據(jù)選擇的對(duì)照藥物和氟康唑抑菌活性對(duì)比實(shí)驗(yàn)顯示，氟康唑和對(duì)照藥物對(duì)白色念珠菌的抑制作用非常明顯，但對(duì)黑曲霉的抑制作用不明顯，同時(shí)氟康唑的抑菌作用明顯高于對(duì)照藥品。由此可知，三氮唑類抗真菌藥物是一種合成抗菌藥物，其合成過(guò)程可在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成，較為簡(jiǎn)便，同時(shí)這種藥物對(duì)真菌的抑制作用比較明顯，具有極大的臨床應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：唑類抗真菌藥物；合成方法；氟康唑；中間體物質(zhì)

中圖分類號(hào)：TQ463 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.15913/j.cnki.kjycx.2015.22.098

唑類抗真菌藥物早在20世紀(jì)60年代末就已經(jīng)被研發(fā)和應(yīng)用，發(fā)展速度較快，對(duì)真菌的抑制作用非常好，但隨著藥物應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大，耐藥菌株數(shù)量也在不斷增加，因此研究者還在不斷完善這類藥物，以求研制出藥效更好的藥物。本文主要研究三氮唑類抗真菌藥物的合成方法和生物活性檢驗(yàn)效果，具體如下。

1 材料及方法

1.1 三氮唑類抗真菌藥物的合成

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

合成實(shí)驗(yàn)原料為間二氟苯，實(shí)驗(yàn)儀器包括恒溫水浴鍋、蒸發(fā)儀、真空泵、紫外線分析儀、攪拌器、烘干箱、調(diào)壓器、紅外光譜儀、核磁共振儀、熔點(diǎn)毛細(xì)管。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)原理

以間二氟苯為原料，通過(guò)傅-克反應(yīng)制得中間體物質(zhì)（2-氯-2，4-二氟苯乙酮），之后利用縮合反應(yīng)將1，2，4-三氮唑（一分子量）接入中間體當(dāng)中，得到2，4-二氟-2（1H-1，2，4-三氮唑-1）-苯乙酮鹽酸鹽。將實(shí)驗(yàn)環(huán)境調(diào)節(jié)為堿性，利用碘化后的三亞基亞砜對(duì)鹽酸鹽的羧基進(jìn)行亞甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，制備得到甲磺酸鹽，最終利用三氮唑?qū)⒀醐h(huán)開環(huán)后即可得到氟康唑。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將11.3 g間二氟苯藥粉與14.7 g無(wú)水三氯化鋁混合，在冰浴下攪拌均勻，緩慢加入氯酰氯，然后將溶液轉(zhuǎn)入室溫環(huán)境中連續(xù)攪拌3 h，攪拌后將混合液倒入冰水當(dāng)中。萃取二氯甲烷，并干燥無(wú)水硫酸鈉，過(guò)濾和蒸發(fā)之后得到的白色針狀結(jié)晶體即為中間體物質(zhì)。

提取氟康唑的具體實(shí)驗(yàn)步驟為：①混合碳酸氫鈉和三氮唑，然后用甲苯溶解混合物質(zhì)，并將溶解后的物質(zhì)放入三口瓶中加熱回流；②用甲苯溶解中間體物質(zhì)，然后將溶解液滴入三口瓶當(dāng)中，反應(yīng)生成的水利用分水器分離，并將溶液溫度冷卻到室溫，采用減壓蒸發(fā)的方式去除甲苯，再用乙酸乙酯和正己烷同體積混合液洗滌得到的固體，最終得到淡黃色結(jié)晶物質(zhì)；③利用甲苯溶解該淡黃色結(jié)晶物質(zhì)后進(jìn)行濃縮，加入乙酸乙酯、甲磺酸，析出甲磺酸鹽結(jié)晶體；④使用無(wú)水碳酸鉀溶解該甲磺酸鹽結(jié)晶體，并加入三氮唑，將反應(yīng)溫度設(shè)定為90 ℃，并連續(xù)攪拌4.5 h，冷卻后加入氯仿進(jìn)行提純，并用水清洗，最后干燥硫酸鎂，減壓蒸發(fā)得到的結(jié)晶物即為氟康唑。

1.2 氟康唑的體外抑菌活性實(shí)驗(yàn)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為合成后的氟康唑藥劑，對(duì)照藥劑為2-（2，4-二氟苯基）-3-（1H-1，2，4-三唑-1-基）-1，2-丙二醇（下簡(jiǎn)稱“對(duì)照藥劑”）。實(shí)驗(yàn)真菌為白色念珠菌和黑曲霉。實(shí)驗(yàn)儀器有超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)床、滅菌器、電子天平和恒溫水浴鍋等。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

將200 g馬鈴薯切成小塊放入1 000 mL水當(dāng)中，將溫度設(shè)定為80 ℃，浸泡超1 h。用紗布過(guò)濾液體，并在100 Pa壓力下滅菌，得到馬鈴薯液。在馬鈴薯液中加入2 g葡萄糖，煮沸后放入瓊脂，邊加熱邊補(bǔ)充水分，在二次高壓滅菌后制得PDA培養(yǎng)基。

在培養(yǎng)基斜面上分別接種白色念珠菌和黑曲霉，然后在29 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間控制在24 h左右，這樣就可以使其保持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。利用接種環(huán)挑出培養(yǎng)后的菌株，放入無(wú)菌蒸餾水當(dāng)中充分震蕩，使其能夠混合均勻。

選擇氟康唑和對(duì)照藥劑各10 mg，用氯仿進(jìn)行溶解，然后將菌液接種在無(wú)菌培養(yǎng)基上，并用濾紙蘸取藥液，用吹風(fēng)機(jī)將其風(fēng)干后放在菌液接種部位的正中央，在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，時(shí)間為2 d，觀察接種菌落的變化。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在同樣的接種濃度下，氟康唑和對(duì)照藥劑對(duì)白色念珠菌均有抑制作用，但兩種藥劑對(duì)黑曲霉的抑制作用不明顯，其中，氟康唑的抑制活性明顯高于對(duì)照藥劑。將抑制后的菌株烘干，氟康唑抑制的白色念珠菌干重為0.024 g，而對(duì)照藥劑抑制的白色念珠菌干重為0.051 g。

在抑制前，黑曲霉的干重為0.099 g，抑制后，氟康唑的干重為0.053 g，而對(duì)照藥劑為0.072 g。由此可知，兩種藥劑對(duì)黑曲霉的活性也有一定的抑制作用，但相比于白色念珠菌，對(duì)黑曲霉的抑制性較低。其中，氟康唑?qū)Π咨钪榫秃谇沟囊种谱饔镁笥趯?duì)照藥劑。

3 討論

三氮唑類藥物屬于抗生素之一，其主要針對(duì)真菌進(jìn)行治療。早在20世紀(jì)60年代末期，國(guó)際醫(yī)學(xué)界就研發(fā)出了克霉唑和咪康唑這兩種唑類藥物，并逐步衍生出三氮唑類藥品，其中以氟康唑、伊曲康唑等的應(yīng)用最為廣泛。但隨著這些藥物應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大，氟康唑的抗菌菌株數(shù)量大幅度提升，而伊曲康唑在服用后所產(chǎn)生的不良反應(yīng)率較高，因此現(xiàn)代醫(yī)學(xué)者還在不斷探索新的藥物。

氟康唑?qū)φ婢囊种谱饔妹黠@，且在發(fā)揮藥效的過(guò)程中不會(huì)對(duì)人體健康細(xì)胞造成影響，也不會(huì)破壞細(xì)胞膜的功能和結(jié)構(gòu)。本次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了氟康唑能夠在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)合成，生產(chǎn)成本較低，能夠滿足現(xiàn)代大批量的生產(chǎn)；同時(shí)，這一藥物對(duì)白色念珠菌和黑曲霉具有較好的抑制作用，尤其對(duì)白色念珠菌的抑制作用突出，臨床應(yīng)用效果更好。

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〔編輯：王霞〕