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    喜樹堿對HaCaT細胞低氧誘導(dǎo)因子1α表達的影響

    2015-12-01 01:09:26張梁宇王翔陸亞琪朱曉楊陳揚
    中華皮膚科雜志 2015年6期
    關(guān)鍵詞:喜樹堿溶媒低氧

    張梁宇 王翔 陸亞琪 朱曉楊 陳揚

    喜樹堿對HaCaT細胞低氧誘導(dǎo)因子1α表達的影響

    張梁宇 王翔 陸亞琪 朱曉楊 陳揚

    目的 觀察喜樹堿對低氧(2%O2)培養(yǎng)下HaCaT細胞低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)表達的影響,探討外用喜樹堿治療銀屑病可能的作用機制。方法 將HaCaT細胞分為實驗組和溶媒組(對照組),實驗組為喜樹堿+DMEM培養(yǎng)液,終濃度分別為12.5、25、50、100、200 nmol/L;溶媒組為含二甲基亞砜(DMSO)的DMEM培養(yǎng)液。不同濃度的喜樹堿作用于HaCaT細胞12、24、48、72 h,CCK8法檢測細胞增殖;用以上濃度處理低氧誘導(dǎo)12 h的HaCaT細胞,Western印跡檢測細胞HIF-1α蛋白的表達。將HaCaT細胞分為常氧組和低氧組,每組內(nèi)再分喜樹堿干預(yù)組(100 nmol/L)和非干預(yù)組(溶媒對照組),培養(yǎng)12 h后實時熒光定量PCR檢測HIF-1α mRNA的相對表達。統(tǒng)計分析采用SPSS16.0軟件進行Levene′s test、單因素方差分析、Dunnett-t檢驗和析因分析。結(jié)果 不同濃度喜樹堿作用12、24、48、72 h后對HaCaT細胞的增殖有抑制作用,呈濃度和時間依賴關(guān)系;200 nmol/L喜樹堿作用12 h,100、200 nmol/L喜樹堿作用24 h細胞增殖抑制率分別為(17.66±6.46)%、(33.11±4.63)%、(56.31± 1.69)%,與同時段溶媒對照組間差異有統(tǒng)計學意義(均P< 0.05)。低氧誘導(dǎo) 12 h,25、50、100、200 nmol/L喜樹堿處理后 HIF-1α蛋白表達分別為0.348±0.065、0.261±0.112、0.115±0.043、0.045±0.024,與溶媒組(1.445±0.329)比較,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。喜樹堿干預(yù)(100 nmol/L)與非干預(yù)的HIF-1α mRNA表達(△Ct值)分別為:常氧組-5.575±0.29、-5.451±0.21;低氧組-6.543±0.57、-6.203±0.31;低氧較常氧條件下HaCaT細胞HIF-1α mRNA的表達下調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(F=29.856,P<0.05);喜樹堿干預(yù)和非干預(yù)組間HaCaT細胞HIF-1α mRNA的表達在常氧和低氧條件下差異無統(tǒng)計學意義(F=1.667,P>0.05)。結(jié)論 100 nmol/L喜樹堿可抑制HaCaT細胞HIF-1α蛋白表達,對HIF-1α mRNA的表達水平無明顯影響。

    銀屑??;喜樹堿;缺氧誘導(dǎo)因子1;細胞低氧;HaCaT細胞

    喜樹堿是從我國特有的山茱萸珙桐科植物喜樹樹皮、樹葉、樹枝及果實中提取的一種生物堿,可靶向選擇性抑制DNA拓撲異構(gòu)酶I(topoisomerase,Topo I),阻礙DNA鏈的閉合,導(dǎo)致細胞DNA單鏈斷裂、細胞死亡[1]。研究表明,喜樹堿可抑制人HaCaT細胞端粒酶活性,抑制其增殖、誘導(dǎo)凋亡[2],并在低氧模擬下能顯著抑制HeLa和HEK293細胞系低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的表達[3]。本研究旨在觀察喜樹堿對低氧誘導(dǎo)HaCaT細胞HIF-1α表達的影響,探討外用喜樹堿治療銀屑病的可能作用機制。

    資料與方法

    一、材料及主要試劑

    喜樹堿(含量>95%)為日本東京化成工業(yè)公司產(chǎn)品,4℃保存。HaCaT細胞系來源于第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院中心實驗室。二甲基亞砜(DMSO,美國Sigma-Aldrich公司),胰酶(以色列Bioind公司)、DMEM培養(yǎng)基(美國Coring公司),胎牛血清(德國PAN-Biotech GmbH公司),CCK8試劑盒(日本同仁化學公司),兔抗人HIF-1α單克隆抗體(美國Abcam公司)。PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

    二、方法

    1.細胞培養(yǎng)及低氧處理:HaCaT細胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng),取對數(shù)生長期的細胞用于各項實驗。預(yù)先設(shè)定低氧培養(yǎng)箱氣體濃度為 2%O2、5%CO2、93%N2;氧濃度穩(wěn)定為2%時,迅速將HaCaT細胞放入培養(yǎng)箱,待氧濃度重新穩(wěn)定于2%后,培養(yǎng)12 h。

    2.藥物處理及分組:喜樹堿以DMSO溶解后,-20℃避光保存,喜樹堿儲備濃度為5 g/L。使用時用DMEM培養(yǎng)液稀釋成工作濃度,DMSO的終濃度≤0.1%。將HaCaT細胞分為實驗組和溶媒組(對照組),實驗組加喜樹堿 +含 10%FBS的DMEM培養(yǎng)液,即喜樹堿的終濃度分別為12.5、25、50、100、200 nmol/L;溶媒組為含 DMSO 的 DMEM 培養(yǎng)液(體積比為0.02∶100)。

    3.CCK8檢測細胞增殖抑制率:將對數(shù)生長期的HaCaT細胞(1×104/ml)接種于96孔板,每孔100 μl在 37 ℃、5%CO2的孵育箱中培養(yǎng) 24 h;去上清液,實驗組每孔加入含一定濃度(12.5、25、50、100、200 nmol/L)喜樹堿的 DMEM 培養(yǎng)基 100 μl,每一濃度設(shè)6個復(fù)孔,對照組加入含0.02 μl DMSO的DMEM培養(yǎng)液100 μl,空白組不加細胞,只加培養(yǎng)基。分別培養(yǎng) 12、24、48、72 h 后,每孔加入含 10 μl CCK8 溶液的無血清培養(yǎng)基 100 μl,37 ℃、5%CO2下孵育1 h,在酶標儀450 nm波長下測量各孔吸光值,細胞增殖抑制率=[1-(加藥組各濃度平均吸光度值-空白組平均吸光度值)/(對照組平均吸收值-空白組平均吸光度值)]×100%。

    4.Western印跡檢測HIF-1α蛋白的表達:將對數(shù)生長期的HaCaT細胞(2×105/ml)接種于6孔板中,每孔2 ml,24 h后,棄上清液,實驗組加入含有不同濃度(12.5、25、50、100、200 nmol/L)的喜樹堿2 ml,對照組以等體積溶媒代替藥物,同時放入低氧(2%O2)誘導(dǎo)箱中分別誘導(dǎo)12 h后,收集各組細胞,提取總蛋白。用BCA法定量試劑盒檢測蛋白濃度:上樣200 μg蛋白,10%SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,5%的脫脂奶粉封閉2 h,加入兔抗人HIF-1α單克隆抗體(1∶1 000),4℃孵育過夜,TBST漂洗 3次,加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2 000)室溫下結(jié)合2 h,洗膜5次后顯色,凝膠成像儀顯影。

    5.實時定量RT-PCR檢測HIF-1α mRNA的表達:實驗分為常氧組和低氧組,每組內(nèi)再分喜樹堿干預(yù)組(100 nmol/L)和非干預(yù)組(溶媒對照組),處理時間均為12 h。收集各組細胞,采用Trizol一步法,常規(guī)方法提取RNA,按RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求進行反轉(zhuǎn)錄并建立PCR反應(yīng)體系。各組均取1 μl cDNA作為PCR反應(yīng)模板,加入SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×)10 μl及上、下游引物(濃度 5 μmol/L)各 1 μl,最后加無 DNsae-RNsae 水至總體積20 μl。PCR 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s,95℃變性15 s,60℃退火15 s,72℃延伸15 s,共 40個循環(huán),于每個循環(huán)延伸段采集熒光信號。以β肌動蛋白為內(nèi)參照,計算目的基因的相對定量△Ct及依此進行統(tǒng)計學分析。引物序列:HIF-1α上游引物5′-CCAGTTACGTTCCTTCGATCAGT-3′,下游引物 5′-TTTGAGGACTTGCGCTTTCA-3′。β肌動蛋白上游引物 5′-AGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3′,下游引物5′-ACCATCACGCCCTGGTGCCT-3′。

    6.統(tǒng)計學處理:實驗重復(fù)3次,取均數(shù)。用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以±s表示,用Levene檢驗方差齊性,方差不齊,進行對數(shù)轉(zhuǎn)換;采用單因素方差分析進行組間比較。組內(nèi)各實驗組與溶媒組比較采用Dunnett-t檢驗。HIF-1α mRNA的表達采用析因設(shè)計的方差分析;P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    結(jié) 果

    一、喜樹堿對HaCaT細胞增殖抑制作用

    與溶媒組比較,12.5、25、50、100、200 nmol/L 喜樹堿作用 12、24、48、72 h對 HaCaT 細胞均有抑制作用,且與時間、濃度呈依賴關(guān)系。隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長,喜樹堿對HaCaT細胞的生長抑制率逐漸增高,見表1。

    與溶媒組相比,200 nmol/L喜樹堿作用12 h后就開始對HaCaT細胞的增殖有明顯的抑制作用,一直到72 h該抑制作用仍很明顯(P<0.05);100 nmol/L喜樹堿作用24 h后開始產(chǎn)生明顯的抑制作用,并且持續(xù)到72 h時,抑制作用仍然明顯(P< 0.05);50 nmol/L 喜樹堿作用 48、72 h時對HaCaT細胞的增殖均有明顯的抑制作用(P<0.05);25 nmol/L喜樹堿作用72 h后才產(chǎn)生明顯的抑制作用,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。喜樹堿處理HaCaT細胞 24、48、72 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別是 125.58、41.91、23.95 nmol/L。

    二、喜樹堿對低氧誘導(dǎo)HaCaT細胞HIF-1α蛋白表達影響

    表1 不同濃度喜樹堿在不同時間對HaCaT細胞增殖抑制率(%,±s)

    表1 不同濃度喜樹堿在不同時間對HaCaT細胞增殖抑制率(%,±s)

    注:n=3。a:與同時段溶媒組比較,P<0.05

    組別(nmol/L) 12 h 24 h 48 h 72 h喜樹堿12.5 nmol/L - 7.59±1.89 6.37±5.79 16.35±3.58 25 nmol/L 2.28±2.11 8.78±2.87 28.69±8.92 61.77±8.13a 50 nmol/L 4.79±5.62 17.11±6.56 57.08±7.88a79.50±7.54a 100 nmol/L 4.67±3.33 33.11±4.63a 85.03±5.31a93.78±3.12a 200 nmol/L 17.66±6.46a 56.31±1.69a 95.10±2.03a98.18±0.46a溶媒組 2.40±4.11 2.14±1.31 3.06±2.90 8.64±7.86

    如圖 1所示,不同濃度喜樹堿(12.5、25、50、100、200 nmol/L)作用于低氧誘導(dǎo)(2%O2)的 HaCaT細胞12 h,HIF-1α蛋白的表達隨喜樹堿濃度的升高而下調(diào),并在100、200 nmol/L喜樹堿濃度下被明顯抑制。經(jīng)單因素方差分析,各濃度喜樹堿對低氧誘導(dǎo)HaCaT細胞HIF-1α蛋白表達有差異(數(shù)據(jù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后Levene檢驗顯示方差齊性,P=0.126;F=31.527,P< 0.05)。組間多重比較顯示,25、50、100、200 nmol/L喜樹堿處理后HIF-1α表達(分別為0.348 ± 0.065、0.261 ± 0.112、0.115 ± 0.043、0.045 ±0.024)與溶媒組(1.445±0.329)比較,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

    圖1 不同濃度喜樹堿對低氧(2%O2)誘導(dǎo)12 h HaCaT細胞HIF-1α蛋白的表達

    三、喜樹堿對低氧誘導(dǎo)HaCaT細胞HIF-1α mRNA表達影響

    100 nmol/L喜樹堿對常氧和低氧條件下HaCaT細胞作用12 h后HIF-1α mRNA的表達水平與相應(yīng)的對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(F=1.667,P>0.05)。但低氧組與常氧組比較HIF-1α mRNA的表達量相對降低,差異有統(tǒng)計學意義(F=29.856,P<0.05)。見表 2。

    討 論

    HIF-1是一種氧依賴轉(zhuǎn)錄活因子,是細胞在缺氧條件下產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄活性核蛋白,由α亞基和β亞基組成異源二聚體,其活性形式為HIF-1α。尋常性斑塊型銀屑病皮損角質(zhì)形成細胞過度增殖,可造成局部微環(huán)境缺氧。研究表明,銀屑病皮損組織中HIF-1α的表達相對于特應(yīng)性皮炎、脂溢性皮炎或正常皮膚組織均明顯增加[4-5],并可調(diào)控與銀屑病皮損真皮乳頭層血管增生相關(guān)的多種靶基因表達,如,血管內(nèi)皮生長因子、環(huán)氧合酶2、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶、基質(zhì)金屬蛋白酶 2[6-8]。HIF-1α與葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(GLUT-1)表達呈正相關(guān),并可能參與銀屑病角質(zhì)形成細胞過度增殖角化不全[9]。因此本研究以低氧誘導(dǎo)的HaCaT細胞為模型,觀察喜樹堿對HIF-1α表達的影響。

    本實驗中,25、50、100、200 nmol/L 喜樹堿均能抑制HaCaT細胞的增殖活性,隨著藥物濃度升高和作用時間延長,呈濃度和時間依賴關(guān)系。200、100、50、25 nmol/L 喜樹堿分別于作用 12、24、48、72 h后開始對 HaCaT 細胞的增殖有明顯的抑制作用,并且持續(xù)到72 h時(P<0.05),而喜樹堿作用 HaCaT 細胞 24、48、72 h 的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別是 125.58、41.91、23.95 nmol/L。用 12.5、25、50、100、200 nmol/L 喜樹堿處理低氧誘導(dǎo)12 h的HaCaT細胞,隨著喜樹堿濃度增加,對HIF-1α蛋白表達抑制作用也增強(圖1),除12.5 nmol/L喜樹堿外,其余4個濃度喜樹堿對細胞HIF-1α蛋白表達與對照組間比較,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。以上結(jié)果均提示低濃度喜樹堿可抑制HaCaT細胞增殖,抑制HIF-1α蛋白表達的藥物濃度較增殖抑制濃度低。

    表2 喜樹堿對不同氧壓條件處理的HaCaT細胞HIF-1α mRNA相對表達量的影響(±s)

    表2 喜樹堿對不同氧壓條件處理的HaCaT細胞HIF-1α mRNA相對表達量的影響(±s)

    注:n=3

    組別 不同氧壓條件常氧組(21%O2) 低氧組(2%O2)喜樹堿100 nmol/L 0.021 297±0.004 252 0.011 549±0.005 569溶媒組 0.023 664±0.003 441 0.013 824±0.002 800

    本實驗低氧誘導(dǎo)12 h的HaCaT細胞HIF-1α mRNA表達較常氧組降低(P<0.05),該現(xiàn)象可能與細胞急性缺氧有關(guān),尚需對多個時間點進一步觀察。Bosco等[10]觀察到低氧誘導(dǎo) 16 h,人外周血單核細胞HIF-1α mRNA表達下降,認為可能存在負反饋調(diào)節(jié)機制。100 nmol/L濃度喜樹堿作用低氧誘導(dǎo)的HaCaT細胞12h,細胞中HIF-1α蛋白表達被明顯抑制,分別觀察同一濃度和時間點喜樹堿對常氧或低氧狀態(tài)下HaCaT細胞HIF-1αmRNA表達的影響,發(fā)現(xiàn)HIF-1α mRNA在喜樹堿干預(yù)前后的表達差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。Bertozzi等[3]以 0.5 μmol/L 喜樹堿作用于去鐵胺低氧模擬下的HeLa和HEK293細胞系,兩種細胞系HIF-1α蛋白水平均被明顯抑制,HeLa細胞系HIF-1α mRNA表達無明顯變化,進一步實驗發(fā)現(xiàn)抑制miR-17-5p、miR-155表達后,能影響喜樹堿對HIF-1α蛋白表達的抑制,提示喜樹堿是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)HIF-1α的表達。本研究結(jié)果表明,喜樹堿對HaCaT細胞HIF-1α mRNA表達的調(diào)控也可能是轉(zhuǎn)錄后水平。

    臨床上,0.03%喜樹堿軟膏被推薦治療慢性斑塊型銀屑病,療效與0.02%丙酸氯倍他索霜相似[11],其藥理機制尚不清楚。文獻[12]報道咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病鼠模型,氯倍他索可通過抑制IL-23/IL-17A炎癥反應(yīng)軸對小鼠皮損有治療作用,但喜樹堿對該炎癥軸無明顯抑制作用,不能有效治療小鼠銀屑病樣皮損表皮增殖。喜樹堿有較強的細胞毒性,對HaCaT細胞HIF-1α蛋白表達有明顯抑制,喜樹堿對慢性斑塊狀銀屑病的治療作用是否與調(diào)控HIF-1α蛋白有關(guān),有待進一步研究。

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    2014-12-17)

    (本文編輯:吳曉初)

    Effects of camptothecin on the expression of hypoxia-inducible factor-1α in HaCaT cells

    Zhang Liangyu,Wang Xiang,Lu Yaqi,Zhu Xiaoyang,Chen Yang.Department of Dermatology,98th Hospital of PLA;98 Clinical Medical College Affiliated to Anhui Medical University,Huzhou 313000,Zhejiang,China

    Chen Yang,Email:98cy@163.com

    ObjectiveTo estimate the effects of camptothecin (CPT)on the expression of hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α)in HaCaT cells under hypoxic conditions (2%O2),and to explore the potential therapeutic mechanism of topical CPT for psoriasis.MethodsSome HaCaT cells were classified into 6 groups:5 test groups cultured in Dulbecco′s modified Eagle′s medium(DMEM)with the presence of CPT at 12.5,25,50,100 and 200 nmol/L respectively,and 1 control group cultured in DMEM with the presence of dimethyl sulfoxide(DMSO).All the 6 groups of cells were cultured under normoxic conditions for 12,24,48 or 72 hours or under hypoxic conditions for 12 hours.Cell counting kit-8 (CCK-8)assay was conducted to estimate the proliferation of HaCaT cells after the normoxic culture,and Western blot to quantify the protein expression of HIF-1α after the hypoxic culture.Some HaCaT cells were classified into a normoxia group(21%O2)and a hypoxia group(2%O2),and each group was divided into a CPT(100 nmol/L)-treated subgroup and a non-intervention subgroup(treated with the vehicle).After 12-hour culture,real-time fluorescencebased quantitative PCR was performed to measure the mRNA expression of HIF-1α.Statistical analysis was carried out by using Levene′.s test,one-way analysis of variance,Dunnett-ttest and factorial analysis with the SPSS16.0 software.ResultsAfter treatment with CPT at 12.5-200 nmol/L for 12-72 hours,the proliferation of HaCaT cells was inhibited in a concentration-and time-dependent manner.More concretely,the cell proliferation rates were inhibited by 17.66%±6.46%,33.11%±4.63%and 56.31%±1.69%respectively in HaCaT cells after 12-hour treatment with 200 nmol/L CPT as well as 24-hour treatment with 100 and 200 nmol/L CPT compared with the control group at the corresponding time points(allP<0.05).The protein expression level of HIF-1α was significantly decreased in HaCaT cells after 12-hour treatment with CPT at 12.5,25,50,100 and 200 nmol/L under hypoxic conditions compared with the control group(0.348±0.065,0.261±0.112,0.115±0.043,0.045±0.024 vs.1.445±0.329,allP<0.05).The mRNA expression level of HIF-1α(expressed as△Ct)in the CPT-treated subgroup and non-intervention subgroup was-5.575 ± 0.29 and-5.451±0.21 respectively in the normoxia group,significantly higher than that in the hypoxia group(-6.543±0.57 and-6.203±0.31 respectively,F=29.856,P<0.05),while there was no significant difference between the CPT-treated and non-intervention subgroups(F=1.667,P>0.05).ConclusionsCPT at 100 nmol/L could inhibit the expression of HIF-1α protein,but had no obvious effect on that of HIF-1α mRNA.

    Psoriasis;Camptothecin;Hypoxia-inducible factor 1;Cell hypoxia;HaCaT cells

    10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.06.010

    南京軍區(qū)醫(yī)學科技創(chuàng)新項目(12Z03);全軍醫(yī)學科技青年培育項目(13QNP045)

    313000浙江湖州,安徽醫(yī)科大學解放軍九八臨床學院,解放軍第九八醫(yī)院皮膚科

    陳揚,Email:98cy@163.com

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