半巢式RT—Realtime PCR檢測南芥菜花葉病毒

粟智平++楊益娥++鄧叢良++李金慶++王穎++段效輝

摘要 根據(jù)南芥菜花葉病毒（ArMV）外殼蛋白（CP）基因的保守序列，設(shè)計合成了3條巢式PCR引物和1條TaqMAN熒光探針，建立了半巢式RT-Realtime PCR檢測ArMV的新方法。該方法有機(jī)地結(jié)合了巢式PCR和TaqMAN探針檢測技術(shù)。第二步半巢式-RT-Realtime PCR既是對第一步信號的進(jìn)一步放大，也是對第一步PCR產(chǎn)物的確認(rèn)，因此，檢測的準(zhǔn)確性、靈敏度比巢式PCR、Realtime PCR等方法高。結(jié)果表明：該方法檢測靈敏度可達(dá)0.06 fg/μL植物總RNA。

關(guān)鍵詞 南芥菜花葉病毒（ArMV）；半巢式RT-Realtime PCR；檢測

中圖分類號 S41-30 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2015）18-0145-03

Dectection of Arabis Mosaic Virus by Semi-Nested RT-Realtime PCR

SU Zhi-ping 1 YANG Yi-e 2 DENG Cong-liang 3 LI Jin-qing 1 WANG Ying 1 DUAN Xiao-hui 1

（1 Yantai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Yantai Shandong 264000； 2 Huitong County Agriculture Bureau of Hunan Province；

3 Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau）

Abstract Three nested primers and one TaqMAN probe were designed according to the CP gene of the Arabis mosaic virus，with which we set up a new method of semi-nested RT-Realtime PCR to detect the ArMV.The nest-PCR and the probe-detection technique were combined maneuverably in this study.The semi-nested RT-Realtime PCR in the second step could both magnify the sigal and validate the result of the first step，which could provide a more sensitive and specific detection of the ArMV.The sensitivity of the method could reach 0.06 fg/μL of total plant RNA.

Key words Arabis mosaic virus（ArMV）；Semi-Nested RT-Realtime PCR；dectection

南芥菜花葉病毒（Arabis mosaic virus，ArMV）可侵染植物約174屬215種，主要危害黃瓜、馬鈴薯、胡蘿卜、櫻桃、葡萄、草莓、大豆、菜豆等經(jīng)濟(jì)作物。其地理分布極廣，在五大洲30余個國家有發(fā)生，屬于世界性病害[1]。在我國未見該病毒危害的報道，是我國對外重要的檢疫性植物病毒，是我國進(jìn)境種子苗木必檢項目，因此開發(fā)出快速、靈敏檢測ArMV的技術(shù)的意義重大[2-3]。

目前，實時熒光PCR、電鏡技術(shù)、RT-PCR、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）等是我國南芥菜花葉病毒的主要檢測技術(shù)[4-9]，但這些技術(shù)均有弊端。該文有機(jī)結(jié)合巢式PCR和實時熒光PCR技術(shù)，建立一套“半巢式RT-Realtime PCR”檢測ArMV的分子技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

馬鈴薯黑環(huán)斑病毒（PBRSV）、馬鈴薯Y病毒脈壞死株系（PVYN）核酸、南芥菜花葉病毒（ArMV）、馬鈴薯X病毒（PVX），由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院動植物檢疫研究所提供。核酸蛋白分析儀為BioPhotometer（德國eppendorf公司）；實時熒光PCR試劑盒，購自美國Invitrogen公司；實時熒光PCR基因擴(kuò)增儀為ABI PARISM 7000（美國ABI公司）；納米磁珠法植物總RNA提取試劑盒由北京出入境檢驗檢疫局提供；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：DRR037A），購自大連寶生物公司（TaKaRa）。

1.2 TaqMAN探針與引物的設(shè)計合成

引物和TaqMAN探針由上海生工合成，探針3′端標(biāo)記淬滅熒光染料tetra-methylcarboxyrhoda mine（TAMRA），5′端標(biāo)記報告熒光染料6-carboxy fluorescent（FAM）。

該研究供設(shè)計3條引物，包括1條下游引物及2條上游引物。上游引物用ArMVF表示，其中ArMVF1序列為：5′-TGCTGAGTTTGAGGCAGCAA-3′，ArMVF2序列為：5-TGGGA AGCCCAACTTCATTT-3，下游引物用ArMVR表示，序列為：5′-CAGTGGTGGGATGGTCAGAAA-3′。TaqMan探針用PVXP表示，序列為：5′（FAM）-CGACTTTGCCAGCCTAGATGCAG-（TAMRA）3′。PCR產(chǎn)物長度ArMVF2/ArMVR為73 bp；ArMVF1/ArMVR為103 bp。3條引物及探針可以組成2套不同的反應(yīng)組合，套1為ArMVF1/ArMVR/ArMVP，套2為ArMVF2/ArMVRArMVP。

1.3 總RNA提取及質(zhì)量控制endprint

分別從感染上述病毒及健康的葡萄葉片（CK1）中用納米磁珠法植物總RNA提取試劑盒提取總RNA，為了獲得其濃度與純度值，測定其OD值（核酸蛋白分析儀BioPhotometer），并以此控制核酸質(zhì)量。

1.4 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

用反轉(zhuǎn)錄試劑盒DRR037A分別將“1.3”中提取的6個植物總RNA及DEPC水對照（CK2）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，以合成cDNA，具體反應(yīng)體系參考文獻(xiàn)[9]。

1.5 實時熒光PCR試驗

1.5.1 引物探針特異性試驗。模板分別是“1.4”中合成的7個cDNA，反應(yīng)體系：在25 μL體系中分別加入PCR buffer（2×）12.5 μL，ROX 0.5μL，上游引物ArMVF1（或ArMVF2）（15 μmol/L）1 μL，下游引物（ArMVR）（15 μmol/L）1 μL，探針（ArMVP）（10 μmol/L）1 μL，cDNA 2.0 μL，補(bǔ)充DEPC水至25 μL，每個cDNA 至少設(shè)置2個重復(fù)；循環(huán)條件為50 ℃、2 min；95 ℃、2 min；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，45 cycles；在ABI PARISM 7000儀器的96孔板中進(jìn)行反應(yīng)。

1.5.2 靈敏度試驗。用滅菌后的DEPC處理水將從感染南芥菜花葉病毒（ArMV）的植物葉片中提取的總RNA分別稀釋為10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1及DEPC 水11個梯度，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行實時熒光PCR靈敏度試驗。實時熒光PCR與反轉(zhuǎn)錄操作同前所述。

1.5.3 2套引物探針的擴(kuò)增效率對比試驗。為比較這2套引物探針的擴(kuò)增效率，用同一個ArMV病毒cDNA為模板，分別用套1組合（ArMVF1/ArMVR/ArMVP）和套2組合（ArMVF2/ArMVR/ArMVP）進(jìn)行實時熒光PCR試驗。實時熒光PCR操作同前。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性試驗PCR擴(kuò)增結(jié)果

套1（ArMVF1/ArMVR/ArMVP）結(jié)果見圖1，套2（ArMVF2/ArMVR/ArMVP）結(jié)果見圖2?？梢钥闯?，除了在ArMV的cDNA為模板的反應(yīng)體系中出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增曲線外，其他5種cDNA模板擴(kuò)增信號均未出現(xiàn)，說明2套引物探針的特異性很好，與預(yù)計符合。

2.2 靈敏度試驗PCR擴(kuò)增結(jié)果

用DEPC處理水稀釋為10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、DEPC水11個梯度，稀釋從帶ArMV的葉片中提取植物總RNA。反轉(zhuǎn)錄分別合成cDNA后，進(jìn)行實時熒光PCR擴(kuò)增。套1和套2結(jié)果見圖3、4?？梢钥闯?，當(dāng)RNA稀釋至10-9（即0.006 fg/μL）時，檢測不到信號，因此該方法檢測的靈敏度可達(dá)10-8，即0.06 fg/μL植物總RNA。

2.3 2套引物探針的擴(kuò)增效率對比試驗結(jié)果

套1組合（ArMVF1/ArMVR/ArMVP）和套2組合（ArMVF2/ArMVR/ArMVP）引物探針的擴(kuò)增效率對比試驗結(jié)果見圖5?？梢钥闯?，這兩引物探針的擴(kuò)增效率幾乎完全一樣。

3 結(jié)論與討論

實時熒光PCR技術(shù)將熒光信號的放大功能和PCR擴(kuò)增系統(tǒng)有機(jī)結(jié)合起來，是口岸生物檢測中的高新技術(shù)。較目前已報道的其他檢測技術(shù)更快速、準(zhǔn)確、靈敏和簡便，在植物檢疫中應(yīng)用前景廣闊[10-11]。

目前，關(guān)于南芥菜花葉病毒檢測主要是ELISA檢測與RT-PCR凝膠電泳方法，前者易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，后者對實驗室易造成污染。也有采用實時熒光PCR的報道。本研究建立了一個“半巢式Real-time PCR”檢測南芥菜花葉病毒的方法，檢測的靈敏度可達(dá)0.06 fg/μL植物總RNA。該方法既提高了檢測靈敏度和準(zhǔn)確性，又解決了由于不同方法而導(dǎo)致2次結(jié)果差異大、對結(jié)果難以判定的問題，能有效減少國際貿(mào)易中可能出現(xiàn)的貿(mào)易爭端。

4 參考文獻(xiàn)

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