頂空氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合同位素峰形校正檢索技術(shù)鑒別芝麻油風(fēng)味成分

馬育松，王 敬，艾連峰，竇彩云，賈海濤，于 猛

(1．河北出入境檢驗(yàn)檢疫局，河北 石家莊 050051;2．河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071000)

芝麻油又稱(chēng)麻油、香油，是以芝麻為原料加工制取的食用植物油［1－2］，其性質(zhì)穩(wěn)定，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、金屬及印染等領(lǐng)域［3］。芝麻含油質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為50%(其中油酸和亞油酸占85%，蛋白質(zhì)約25%)，還含有大量的硬脂酸、棕櫚酸、花生酸和亞麻酸等。由于不飽和脂肪酸含量很高，所以芝麻油有提高腦細(xì)胞活力、改善血液循環(huán)、延緩衰老等功能［4］。同時(shí)，芝麻油還含有多種天然抗氧化劑，包括芝麻酚、芝麻素、芝麻酚林、芝麻素酚、芝麻林素酚和維生素E等［5］，比其他植物油更易保存。由于芝麻油的市場(chǎng)售價(jià)遠(yuǎn)高于大豆油、棉籽油等常見(jiàn)食用植物油，部分生產(chǎn)及經(jīng)營(yíng)者為牟取暴利，在芝麻油中摻入廉價(jià)的油脂(如菜籽油、棉籽油、棕櫚油等);或直接用香精和香料勾兌優(yōu)質(zhì)油品，以降低生產(chǎn)成本，牟取暴利;甚至將禁用的有毒、非食用的礦物油、桐油、大麻油等摻入油脂中，或?qū)⑦^(guò)期變質(zhì)油品摻入合格油品以次充好［6］。這些行為嚴(yán)重侵害了消費(fèi)者的合法利益并且擾亂了正常的市場(chǎng)秩序，使得芝麻油質(zhì)量問(wèn)題越來(lái)越受到社會(huì)的關(guān)注。

芝麻油的風(fēng)味成分由濃度極低、種類(lèi)繁多且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的各種揮發(fā)性物質(zhì)組成，目前普遍采用氣相色譜－質(zhì)譜(GC－MS)對(duì)其風(fēng)味成分進(jìn)行分析［7］，該技術(shù)利用保留時(shí)間和NIST譜庫(kù)檢索對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定性。然而，僅靠譜庫(kù)檢索來(lái)推斷化合物的元素組成存在很大的不確定性，往往會(huì)出現(xiàn)NIST庫(kù)檢索匹配率不高，或幾個(gè)待選物的匹配率相似等情況。自然界中很多元素(如C，H，O和N等)都有固定的同位素，每種同位素在自然界的豐度為一個(gè)固定值，因此可將質(zhì)譜圖中同位素峰的相對(duì)豐度用于精確相對(duì)分子質(zhì)量的校正技術(shù)。近年來(lái)美國(guó)Cerno Bioscience公司利用同位素規(guī)律開(kāi)發(fā)出一種軟件(Mass-WorksTM)用于校正計(jì)算精確相對(duì)分子質(zhì)量［8］，該軟件通過(guò)建立校正函數(shù)方程，并將同位素效應(yīng)、儀器噪音過(guò)濾、峰形補(bǔ)償納入函數(shù)方程中，經(jīng)過(guò)計(jì)算校正質(zhì)譜輪廓圖，可以在單位分辨質(zhì)譜上測(cè)定精確質(zhì)量數(shù)，并利用其獨(dú)有的同位素峰形校正檢索技術(shù)(CLIPs)，準(zhǔn)確識(shí)別目標(biāo)物的分子式［9］。目前該方法已在藥物分子及代謝產(chǎn)物的鑒定、環(huán)境與安全和農(nóng)獸藥的定性研究中得到應(yīng)用，但在食用油的定性分析中未見(jiàn)報(bào)道。本文采用頂空氣相色譜－質(zhì)譜法測(cè)定了市售芝麻油的揮發(fā)性風(fēng)味成分，利用MassWorksTM技術(shù)同時(shí)校正精確質(zhì)量數(shù)和同位素峰形，探索了一種在低分辨率單四極桿質(zhì)譜儀上對(duì)芝麻油風(fēng)味成分進(jìn)行快速、靈敏和可靠定性分析的方法，為進(jìn)一步對(duì)芝麻油摻偽的鑒別提供了可靠依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent GC－MS 7890A/5975C氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀(配Agilent 7697A自動(dòng)頂空進(jìn)樣器，美國(guó)安捷倫公司)，20 mL頂空瓶(美國(guó)安捷倫公司)。

1.2 芝麻油樣品

實(shí)驗(yàn)用油為石家莊農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)或超市購(gòu)得的50批次芝麻香油。制油工藝包括水代法和壓榨法;原料品種包括黑芝麻和白芝麻;產(chǎn)地包括河北、山東、河南、廣東、坦桑尼亞和山西等地。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

取10 mL芝麻油于20 mL頂空瓶中，用橡膠密封墊及鋁蓋封口，放入頂空進(jìn)樣器中，按程序加熱平衡后，頂空氣體由GC－MS進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化樣品體積、揮發(fā)溫度、平衡時(shí)間及程序升溫等條件，選取最佳儀器分析條件。

1.4 儀器條件

頂空程序:頂空平衡溫度200℃，定量管溫度210℃，傳輸線溫度220℃;平衡時(shí)間:20 min。

色譜條件:DB－624(60 m×0.25 mm×1.4 μm)毛細(xì)管色譜柱;進(jìn)樣口溫度:250℃;載氣流速:1 mL/min;程序升溫:初始溫度60℃，保持5 min，以10℃/min升至100℃，保持5 min，以5℃/min升至250℃，保持5 min;分流比:5∶1。

質(zhì)譜條件:離子源(EI)溫度:230℃;四極桿溫度:150℃;傳輸線溫度:250℃;閾值:0;掃描方式:原始掃描;質(zhì)量掃描范圍:30～400 Da。以全氟三丁胺(PFTBA)標(biāo)準(zhǔn)品為外標(biāo)對(duì)質(zhì)譜進(jìn)行校正。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用MassWorksTM校正質(zhì)量軸和質(zhì)譜峰形，是獲得精確質(zhì)量數(shù)的關(guān)鍵。通過(guò)校正，可以將原始的質(zhì)譜圖轉(zhuǎn)變?yōu)樾Ｕ|(zhì)譜圖，并確定目標(biāo)物的精確質(zhì)量數(shù);再經(jīng)過(guò)同位素峰形校正檢索技術(shù)(CLIPs)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物分子式的準(zhǔn)確識(shí)別。以MassWorksTM軟件用標(biāo)記的PFTBA平均質(zhì)譜圖為基準(zhǔn)，對(duì)質(zhì)量軸和質(zhì)譜峰形進(jìn)行校正，建立校正函數(shù)，PFTBA具有豐富的碎片分布，可對(duì)40～550 Da全部的質(zhì)譜圖進(jìn)行校正。然后利用MassWorksTM軟件將校正函數(shù)運(yùn)用到芝麻油的一級(jí)全掃描Profile質(zhì)譜圖進(jìn)行校正計(jì)算，獲得目標(biāo)物的精確質(zhì)量數(shù)，將校正函數(shù)應(yīng)用到GC－MS采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)中，以獲得高的譜圖精度并準(zhǔn)確識(shí)別目標(biāo)物分子式。

2 結(jié)果與討論

2.1 芝麻油的主要揮發(fā)性成分

按照優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件對(duì)芝麻油中的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，得到了揮發(fā)性成分的總離子流圖(見(jiàn)圖1)。利用NIST 08標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行初步定性，以MassWorksTM質(zhì)譜解析軟件對(duì)質(zhì)譜圖進(jìn)行校正，模擬計(jì)算出組分的精確分子質(zhì)量，經(jīng)CLIPs檢索得到組分的元素組成。綜合兩種分析方法的結(jié)果，并按照峰面積歸一化法計(jì)算出各組分的相對(duì)百分含量，最終確定市售芝麻油風(fēng)味成分中的71種化合物，占總檢出化合物的90.2%(見(jiàn)表1)。這些成分主要包括14種醛類(lèi)、13種吡嗪類(lèi)、9種呋喃類(lèi)、5種吡咯類(lèi)、4種噻唑類(lèi)、6種酚類(lèi)、2種吡啶類(lèi)、2種吲哚類(lèi)、2種酸類(lèi)、1種醇類(lèi)、1種酯類(lèi)、1種唑類(lèi)、1種噻吩類(lèi)、4種烴類(lèi)、3種酮類(lèi)和3種含硫化合物。其中，含量較大的4類(lèi)物質(zhì)為醛類(lèi)(37.4%)、酚類(lèi)(20.1%)、吡嗪類(lèi)(10.0%)和呋喃類(lèi)(6.7%)。這些物質(zhì)的協(xié)同作用形成了芝麻油的特有風(fēng)味。

圖1 芝麻油揮發(fā)性成分的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of volatile compounds of sesame oil

醛類(lèi)物質(zhì)因感官閾值一般較低，對(duì)芝麻油香味的整體貢獻(xiàn)較大。正己醛在醛類(lèi)物質(zhì)中含量最高，達(dá)12.8%，其次是壬醛、順-2-庚烯醛和反，反-2，4-癸二烯醛。醛類(lèi)具有脂肪和水果等香氣特征，還可能表現(xiàn)出辛辣的刺激性氣味［10－11］。例如，己醛呈現(xiàn)生的油脂和青草氣及蘋(píng)果香味，常存在于蘋(píng)果、草莓、茶葉、苦橙、咖啡中。烯醛具有油脂香、清香、果香。壬醛能散發(fā)出類(lèi)似玫瑰花香氣的氣味。

吡嗪類(lèi)物質(zhì)具烘烤、堅(jiān)果香、咖啡、肉香等香氣特征，占芝麻油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的10.0%，是芝麻油香氣的主要成分［12］。其中，含量較高的吡嗪類(lèi)物質(zhì)有2-甲基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、2，6-二甲基吡嗪和2-乙基-5-甲基吡嗪。含氮的吡嗪類(lèi)物質(zhì)主要通過(guò)美拉德反應(yīng)生成。吡嗪類(lèi)物質(zhì)的香氣感官閾值較低，香氣的擴(kuò)散性較好，香味濃郁。如甲基吡嗪具有堅(jiān)果香、霉香、烤香和壤香。

呋喃類(lèi)物質(zhì)是芝麻油具有特殊風(fēng)味的重要因素之一。其中，2-戊基呋喃的含量最高，達(dá)到3.4%，其次是5-甲基糠醛、2-糠醇和糠醛。呋喃類(lèi)物質(zhì)具焦甜氣味，使含有這種物質(zhì)的食品呈現(xiàn)濃郁的烤芝麻油香甜味，其中最能體現(xiàn)芝麻油香甜味特征的物質(zhì)是2-糠醇。

酚類(lèi)物質(zhì)的含量較高，其中芝麻酚的含量最高，達(dá)到16%，酚類(lèi)化合物呈現(xiàn)似木香、煙熏香和焦香;含硫類(lèi)物質(zhì)也是芝麻油風(fēng)味成分中不可缺少的一類(lèi)物質(zhì)，一般帶有類(lèi)似新鮮洋蔥的味道，主要通過(guò)熱降解含硫氨基酸生成;噻唑類(lèi)物質(zhì)所占的比例很低，這類(lèi)物質(zhì)在濃度高時(shí)有特殊臭味，但濃度很低時(shí)具有牛肉香味、爆玉米、堅(jiān)果、烘烤花生等香氣，可能是半氨酸或胱氨酸分解物與糖的分解產(chǎn)物相互作用的結(jié)果;其他幾類(lèi)化合物，如吡啶類(lèi)、吡咯類(lèi)、噻吩類(lèi)、吲哚類(lèi)、唑類(lèi)、醇類(lèi)、酸類(lèi)、酯類(lèi)和烴類(lèi)等，雖然每類(lèi)物質(zhì)個(gè)數(shù)少，含量低，但也是芝麻油風(fēng)味成分不可或缺的物質(zhì)。因此，芝麻油的香味是多種物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果。

表1 芝麻油的主要揮發(fā)性成分分析(n=50)Table 1 Identification of main volatile compounds in sesame oil(n=50)

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

2.2 質(zhì)譜解析結(jié)果的分析

將MassWorksTM軟件和譜庫(kù)檢索技術(shù)相結(jié)合用于未知物的質(zhì)譜解析，尤其是對(duì)于譜庫(kù)檢索匹配度不高的化合物，不僅能充分發(fā)揮MassWorksTM準(zhǔn)確識(shí)別元素組成的優(yōu)勢(shì)，而且能快速確定化合物結(jié)構(gòu)，使質(zhì)譜解析的結(jié)果更加可靠。另外，MassWorksTM還可根據(jù)其獨(dú)有的同位素峰形校正檢索功能(CLIPs)，通過(guò)建立元素組成已知的一個(gè)或多個(gè)離子生成的校正函數(shù)，對(duì)質(zhì)譜峰的精確質(zhì)量數(shù)和同位素峰形同時(shí)進(jìn)行校正匹配，以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物分子式的準(zhǔn)確識(shí)別，從而大大提高了低分辨質(zhì)譜定性的準(zhǔn)確度［13-16］。例如，34.063 min的5-甲基-1H-吡咯醛，其N(xiāo)IST譜庫(kù)檢索結(jié)果并不理想，匹配度僅為9.47%，排在檢索結(jié)果中的第5位。而在圖2和表2 MassWorksTM的結(jié)果中，其分子式排在11個(gè)候選分子式的第1位，譜圖準(zhǔn)確度為98.583 7%，且得到不飽和度值為4的信息也進(jìn)一步對(duì)結(jié)果進(jìn)行確證，從而實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物分子式的準(zhǔn)確識(shí)別。由此可見(jiàn)，排序最高的化合物并不一定是目標(biāo)物，而通過(guò)MassWorksTM校正得到的譜圖準(zhǔn)確度和質(zhì)量精度為GC－MS譜庫(kù)檢索提供了高度可靠的確證。對(duì)于互為同分異構(gòu)體的正丁醛和異丁醛、正戊醛和異戊醛等物質(zhì)，MassWorksTM與高分辨質(zhì)譜儀(如:TOF和Orbitrap)一樣，僅依據(jù)精確質(zhì)量數(shù)和元素構(gòu)成，無(wú)法完成對(duì)異構(gòu)體的準(zhǔn)確識(shí)別，需通過(guò)其他方法來(lái)輔助確定其結(jié)構(gòu)，文中涉及到的幾種同分異構(gòu)體，是通過(guò)利用各自的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行色譜分離后，根據(jù)不同的保留時(shí)間加以確證。

圖2 MassWorksTM測(cè)定5-甲基-1H-吡咯醛分子式結(jié)果Fig.2 Formula results of 1H-pyrrole-2-carboxaldehyde，5-methyl-by MassWorksTM

表2 5-甲基-1H-吡咯醛的CLIPs檢索匹配結(jié)果Table 2 The CLIPs results of 1H-pyrrole-2-carboxaldehyde，5-methyl-

3 結(jié)論

芝麻油的風(fēng)味成分主要為吡嗪、呋喃、吡咯、吡啶、噻吩、吲哚、唑等雜環(huán)化合物以及酚類(lèi)、硫醇、硫醚等化合物，這些化合物對(duì)芝麻油的香味有著不同的貢獻(xiàn)，芝麻油的特殊風(fēng)味是多種成分協(xié)同作用的結(jié)果。在本文建立的色譜條件下，可以完成對(duì)芝麻油中71種風(fēng)味成分的分析;同時(shí)，通過(guò)解析芝麻油風(fēng)味成分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)可知，僅依靠質(zhì)譜譜庫(kù)檢索來(lái)確定未知化合物是不夠的，同位素峰形校正檢索技術(shù)通過(guò)模擬計(jì)算出的精確分子量，可準(zhǔn)確地確定化合物的元素組成，不僅彌補(bǔ)了低分辨率四極桿質(zhì)譜的不足，也為芝麻油揮發(fā)性成分的分析提供了新思路。

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