全氟丙酸與人血清白蛋白結(jié)合作用機(jī)制的計(jì)算模擬與光譜法研究

易忠勝，王海洋，伍智蔚，張愛茜

(1．桂林理工大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 桂林 541004;2．中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085)

全氟化合物(PFCs)憑借其優(yōu)良的熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性、表面活性及疏水、疏油性能，被大量應(yīng)用于紡織、化工、電子、制藥、航空、電鍍行業(yè)等領(lǐng)域［1－2］。由于全氟化合物含有具極高化學(xué)鍵能(鍵能約為110 kJ/mol)的C—F共價(jià)鍵，因此這類化合物普遍具有很高的穩(wěn)定性，能夠經(jīng)受很強(qiáng)的熱、光照、化學(xué)作用、微生物作用以及高等脊椎動(dòng)物的代謝作用而不降解，在環(huán)境中能持久存在，并能夠富集于生物體內(nèi)［3］，是一類普遍存在于環(huán)境中的污染物質(zhì)，目前在全球幾乎所有的環(huán)境介質(zhì)中均可檢出，甚至在人體的血液中也有檢出［4］。毒理學(xué)研究表明全氟化合物具有多臟器毒性，對(duì)人體健康存在潛在威脅［5］。

人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是人體血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，體液中的HSA不僅是維持血漿滲透壓的主要成分，且其內(nèi)源熒光參與多種內(nèi)源性物質(zhì)(如脂肪酸、膽色素、氨基酸、激素)、外源性物質(zhì)(如金屬離子、藥物小分子等)的存儲(chǔ)和轉(zhuǎn)運(yùn)［6］;同時(shí)，有機(jī)小分子進(jìn)入人體后，通過血漿的儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)竭_(dá)受體部位，進(jìn)而與HSA發(fā)生相互作用，限制其進(jìn)一步運(yùn)輸［7］，從而對(duì)人體代謝產(chǎn)生影響［8］。利用光譜法研究有機(jī)小分子與HSA相互作用具有方便、快速的特點(diǎn)［9］，因而，HSA通常用作研究小分子與大分子相互作用的模型蛋白。

環(huán)境中的PFCs主要有全氟羧酸類和全氟磺酸類兩種［5］。其中全氟丙酸是一種含氟精細(xì)化工產(chǎn)品，作為含氟農(nóng)藥、醫(yī)藥和聚合物合成的重要中間體，應(yīng)用廣泛，其化學(xué)和生物性質(zhì)穩(wěn)定，在自然環(huán)境中不易被降解，容易在生物體內(nèi)富集，威脅人體健康［10］。目前PFCs對(duì)人類的毒性效應(yīng)僅限于人群的流行性病學(xué)研究［11］，但PFCs與HSA相互作用的機(jī)理仍不甚清楚。本文以全氟丙酸(IPC－PFFA－3)為例，通過計(jì)算模擬和實(shí)驗(yàn)分析兩個(gè)方面探究其與HSA相互作用的機(jī)制(結(jié)構(gòu)見圖1)，以期為研究全氟化合物與HSA的毒理作用提供有用信息。

圖1 人血清白蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及全氟丙酸的分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Second structure of human serum albumin(HSA)and molecular structure of pentafluoropropionic acid

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

RF－5301PC熒光光度計(jì)(日本島津公司);EL204電子分析天平(梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司);PHS－3C精密pH計(jì)(上海雷磁儀器廠)。

pH 7.4的0.1 mol·L－1三氨基甲烷－鹽酸緩沖溶液(Tris－HCl);HSA(美國Sigma公司)用Tris－HCl緩沖溶液配制成濃度為1.0×10－5mol·L－1的儲(chǔ)備液;全氟丙酸(IPC－PFFA－3，瑞士AD公司)用Tris－HCl緩沖溶液配制成濃度為1.0×10－3mol·L－1的儲(chǔ)備液;將配好的全氟丙酸稀釋10倍，搖勻，置于4℃冰箱中備用。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

1.2 計(jì)算模擬

本文所有的計(jì)算工作均在DELL服務(wù)器、RedHat Linux 5.0系統(tǒng)上完成。使用Sybyl x1.1軟件進(jìn)行分子對(duì)接，GROMACS4.5.5軟件進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，VMD軟件進(jìn)行分子圖形展示和結(jié)果分析。所用的HSA晶體結(jié)構(gòu)(代碼為1N5U)從Brookhaven蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/pdb)獲得，該晶體在同類蛋白質(zhì)中具有E－value小同源性高的特點(diǎn)。

1.3 光譜法

在10 mL比色管中準(zhǔn)確移入1 mL 1.0×10－5mol·L－1HSA溶液和2 mL pH 7.4的Tris－HCl緩沖溶液，用移液槍依次加入1.0×10－4mol·L－1IPC－PFFA－3溶液，用水定容至刻度，搖勻，在設(shè)定溫度(291，298，310 K)下恒溫10 min，測(cè)定體系的激發(fā)波長為280 nm、激發(fā)光柵和發(fā)射光柵的狹縫寬度為3.0 nm/5.0 nm處的熒光光譜，并檢測(cè)Δλ=15 nm以及Δλ=60 nm時(shí)的同步熒光光譜，以華法林和布洛芬作為熒光探針測(cè)定體系的競(jìng)爭實(shí)驗(yàn)熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 IPC－PFFA－3與HSA復(fù)合物構(gòu)象變化

2.1.1 分子動(dòng)力學(xué)模擬研究 分子動(dòng)力學(xué)模擬可以研究復(fù)合物小分子在水溶液中的穩(wěn)定性及其動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。模擬時(shí)間為10 ns時(shí)，HSA－IPC－PFFA－3復(fù)合物與HSA的相對(duì)初始結(jié)構(gòu)偏差(RMSD)隨時(shí)間的變化情況見圖2A，其中HSA－IPC－PFFA－3體系的RMSD值低于HSA體系的值且波動(dòng)較小，這說明IPC－PFFA－3與HSA的結(jié)合使HSA體系趨于穩(wěn)定，兩者結(jié)合也更為牢固［12］。從圖2B可以看出，HSA－IPC－PFFA－3體系的均方根波動(dòng)(RMSF)與HSA體系的RMSF變化趨勢(shì)相似，大小有微弱變化，這反映了動(dòng)力學(xué)模擬過程中IPC－PFFA－3的結(jié)構(gòu)域未發(fā)生較大的位置變化，但蛋白質(zhì)殘基的柔性發(fā)生改變。從10 ns的回轉(zhuǎn)半徑(Rg)隨時(shí)間的變化情況(圖2C)可以看出，每個(gè)系統(tǒng)的Rg值在2 ns后達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定，表示動(dòng)力學(xué)模擬在2 ns后很快達(dá)到平衡。而HSA－IPC－PFFA－3體系的Rg值高于HSA體系，表明IPC－PFFA－3使HSA的緊密度發(fā)生變化，結(jié)構(gòu)變得膨脹、松散，導(dǎo)致其空腔增大，進(jìn)而引起HSA的構(gòu)象變化［13］。

圖2 IPC－PFFA－3與HSA分子動(dòng)力學(xué)模擬Fig.2 Molecular dynamics of IPC－PFFA－3 and HSA

2.1.2 IPC－PFFA－3與HSA的同步熒光光譜 HSA中氨基酸殘基的最大熒光波長與其所處環(huán)境的極性有關(guān)，所以可通過觀察HSA的同步熒光光譜來分析蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化［14］。當(dāng)Δλ=15 nm時(shí)只表現(xiàn)出酪氨酸殘基(Tyr)的熒光特征，當(dāng)Δλ=60 nm時(shí)只表現(xiàn)出色氨酸殘基(Trp)的熒光特性［15］。

圖3 IPC－PFFA－3與HSA相互作用的同步熒光光譜Fig.3 Synchronous fluorescence spectra of HSA obtained in the absence and presence of increasing IPC－PFFA－3

從IPC－PFFA－3與HSA體系的同步熒光光譜圖可以看到，Trp和Tyr的熒光強(qiáng)度均隨著IPC－PFFA－3濃度的增加而下降，說明IPC－PFFA－3對(duì)HSA熒光有猝滅作用。Tyr(Δλ=15 nm)熒光峰的最大發(fā)射波長始終保持在351 nm處(見圖3A)，而 Trp(Δλ=60 nm)熒光峰的最大發(fā)射波長隨IPC－PFFA－3濃度的增加發(fā)生微弱的紅移(見圖3B)，波長由351 nm移至352 nm，說明IPC－PFFA－3的加入使HSA中Trp附近的微環(huán)境極性增加，減小了疏水性，進(jìn)而影響了HSA的構(gòu)象，但對(duì)于Tyr附近的微環(huán)境無影響。

2.2 IPC－PFFA－3與HSA的相互作用

2.2.1 IPC－PFFA－3與HSA的分子對(duì)接 利用分子對(duì)接可從理論上模擬預(yù)測(cè)IPC－PFFA－3與HSA相互作用的結(jié)合情況，并可以顯示兩者之間的作用力類型。研究發(fā)現(xiàn)藥物分子與HSA的結(jié)合位點(diǎn)位于ⅡA和ⅢA，即位點(diǎn)Ⅰ(華法林位點(diǎn))和位點(diǎn)Ⅱ(布洛芬位點(diǎn))［16］。計(jì)算過程利用CH4，C‖O與N—H為分子探針，自動(dòng)探測(cè)結(jié)合位點(diǎn)，將優(yōu)化后的IPC－PFFA－3小分子與蛋白質(zhì)HSA的位點(diǎn)Ⅰ和Ⅱ處分別進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果表明位點(diǎn)Ⅱ的Total_Score函數(shù)得分較高(SiteⅠ:2.640 3，SiteⅡ:3.565 1)，說明位點(diǎn)Ⅱ?qū)拥玫降膹?fù)合物更穩(wěn)定。此結(jié)果與后文的競(jìng)爭實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合，由此可以推斷IPC－PFFA－3與HSA的結(jié)合部位主要為位點(diǎn)Ⅱ。Total_Score函數(shù)主要考慮了氫鍵作用、疏水作用、極性作用和溶劑化等因素。通過結(jié)合自由能計(jì)算，結(jié)果表明位點(diǎn)Ⅱ(ΔG=－21.867 5 kJ·mol－1)與IPC－PFFA－3的結(jié)合能力比位點(diǎn)Ⅰ(ΔG=－15.689 4 kJ·mol－1)更強(qiáng)。圖4A，B分別顯示了IPCPFFA－3與HSA在SiteⅠ與SiteⅡ的對(duì)接作用，圖4C顯示了IPC－PFFA－3周圍5范圍內(nèi)的氨基酸殘基(ARG348，ARG485，LEU453，LEU457，LEU387，LEU345，PRO486，PRO384，UNK1，VAL344，SER342，GLU450，MET446，ILE388，ALA449)。從圖4D可以看到IPC－PFFA－3與HSA對(duì)接后在SiteⅡ與ARG485，SER342和ARG348以7個(gè)氫鍵穩(wěn)定結(jié)合，而位點(diǎn)Ⅰ中IPC－PFFA－3與HSA并未存在氫鍵作用。由此可以推斷IPC－PFFA－3與HSA的位點(diǎn)Ⅱ結(jié)合更穩(wěn)定。

圖4 IPC－PFFA－3與HSA的分子對(duì)接圖Fig.4 Molecular docking and detailed view of the interactions of IPC－PFFA－3 and HSA

2.2.2 IPC－PFFAs－3對(duì)HSA的熒光猝滅作用 蛋白質(zhì)中因含有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸殘基，而具有較強(qiáng)的內(nèi)源性熒光，當(dāng)IPC－PFFA－3與HSA結(jié)合時(shí)可使蛋白質(zhì)的組成結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光強(qiáng)度。因此，在模擬人體生理?xiàng)l件下，對(duì)一系列含有相同濃度HSA和不同濃度IPC－PFFA－3的溶液進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)試。如圖5所示，在298 K下，HSA在352 nm處有1個(gè)強(qiáng)熒光峰，隨著IPC－PFFA－3濃度的增加，HSA的熒光發(fā)射光譜峰形不變，熒光位置出現(xiàn)輕微紅移(為4 nm)，熒光強(qiáng)度依次降低，說明IPC－PFFA－3進(jìn)入HSA的疏水腔內(nèi)發(fā)生相互作用形成復(fù)合物，引起了HSA構(gòu)象的變化，最終導(dǎo)致HSA的熒光發(fā)生猝滅。

2.2.3 IPC－PFFA－3對(duì)HSA的熒光猝滅機(jī)理及猝滅常數(shù) 熒光猝滅過程可分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅。動(dòng)態(tài)猝滅是由猝滅化合物分子和具有熒光性質(zhì)的化合物發(fā)生相互作用而產(chǎn)生。靜態(tài)猝滅是指猝滅劑分子與能發(fā)熒光的分子之間借助分子間力，彼此結(jié)合對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響而導(dǎo)致熒光體熒光強(qiáng)度猝滅。動(dòng)態(tài)猝滅過程遵循Stern－Volmer方程［17］:

式中:F0和F分別表示加入猝滅物質(zhì)前后的熒光值，［Q］為猝滅物質(zhì)的濃度，KSV為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù);Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù);τ0為未加入猝滅物質(zhì)時(shí)熒光物質(zhì)本身的平均壽命(約為108s)［18］。由F0/F與［Q］的線性方程，可以得到猝滅物質(zhì)分子對(duì)熒光物質(zhì)分子的猝滅常數(shù)。

圖5 IPC－PFFA－3與HSA的熒光猝滅圖Fig.5 Fluorescence quench titration of HSA with increasing IPC－PFFA－3 concentrations

在溫度分別為291，298，310 K時(shí)，考察了依次加入10 μL 1 ×10－7mol·L－1IPC － PFFA －3 后HSA(1×10－6mol·L－1)熒光強(qiáng)度的變化情況。由表1可知，隨著溫度的升高，KSV減小，Kq大于各類猝滅劑對(duì)蛋白質(zhì)大分子的最大分散碰撞常數(shù)(2×1010L·mol－1·s－1)，表明IPC－PFFA－3對(duì)HSA的猝滅可能是猝滅劑IPC－PFFA－3與熒光物質(zhì)分子HSA在基態(tài)時(shí)發(fā)生了配合反應(yīng)，IPC－PFFA－3進(jìn)入了HSA的空腔內(nèi)，對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和生理活性產(chǎn)生了影響，從而導(dǎo)致熒光的靜態(tài)猝滅［19］。

2.2.4 IPC－PFFA－3與HSA的表觀結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù) 當(dāng)小分子與大分子結(jié)合時(shí)，其結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)由下式求出［20］:

式中n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，Ka為表觀結(jié)合常數(shù)。由lg［(F0－F)/F］與lg［Q］的線性方程，可以得出直線的斜率為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，截距為lgKa。依據(jù)公式(2)得到不同溫度下IPC－PFFA－3對(duì)HSA熒光猝滅的雙對(duì)數(shù)曲線，由該直線的斜率和截距即可求出化合物IPC－PFFA－3與HSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n及表觀結(jié)合常數(shù)Ka(見表1)。

表1 不同溫度下IPC－PFFA－3與HSA的熒光猝滅常數(shù)Ksv、表觀結(jié)合常數(shù)Ka、猝滅速率常數(shù)(Kq)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n和相關(guān)系數(shù)RTable 1 Apparent quenching constants(Ksv)，binding constants(Ka)，quenching rate constant(Kq)，binding sites(n)and correlation coefficient(R)of IPC－PFFA－3－HSA interaction at different temperatures

由表1可知，IPC－PFFA－3對(duì)HSA熒光猝滅的雙對(duì)數(shù)曲線在不同溫度下均具有良好的線性關(guān)系(R≥0.994 6)。它們相互作用的表觀結(jié)合常數(shù)均在105L·mol－1數(shù)量級(jí)以上。表觀結(jié)合常數(shù)隨著溫度的增加而減小，從而驗(yàn)證了IPC－PFFA－3對(duì)HSA的熒光猝滅機(jī)制是靜態(tài)猝滅。結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n≈1，說明在IPC－PFFA－3與HSA作用時(shí)可能有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。IPC－PFFA－3進(jìn)入血液后通過人血清白蛋白具有運(yùn)輸、轉(zhuǎn)載的特性，將IPC－PFFA－3運(yùn)輸?shù)饺梭w器官的各個(gè)部位，進(jìn)而產(chǎn)生代謝。而IPC－PFFA－3是一種毒性的小分子，其通過與人血清白蛋白穩(wěn)定結(jié)合而被運(yùn)輸，進(jìn)而對(duì)人體代謝有一定的影響。

2.2.5 IPC－PFFA－3與HSA的競(jìng)爭結(jié)合位點(diǎn) 研究表明，華法林(Warfarin)和布洛芬(Ibuprofen)與HSA的結(jié)合位點(diǎn)分別為SiteⅠ和SiteⅡ［21－22］，具有特異性結(jié)合的特點(diǎn)。為了探明PFCs在HSA上的結(jié)合位置，本文以Warfarin和Ibuprofen分別作為HSA結(jié)合位點(diǎn)(SiteⅠ和SiteⅡ)的分子探針，利用競(jìng)爭實(shí)驗(yàn)的方法，以確定PFCs在HSA上的結(jié)合位置。通過競(jìng)爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)，結(jié)合修正后的Stern－Volmer方程:

以F0/(F0－F)對(duì)1/［Q］作圖，依據(jù)直線的斜率和截距可求出表觀結(jié)合常數(shù)Ka。通過比較加入Warfarin(或Ibuprofen)前后的Ka值可以推斷IPC－PFFAs－3在HSA上的結(jié)合位置。

利用公式(3)計(jì)算兩者的結(jié)合常數(shù)Ka值。結(jié)果表明未加探針之前IPC－PFFA－3的Ka為1.40×106L·mol－1，加入布洛芬后，Ka變化較明顯(Ka=0.59×105L·mol－1);而加入華法林后，Ka的變化幾乎可以忽略，探針與IPC－PFFA－3結(jié)合在各自的作用部位上，由此說明IPC－PFFA－3在HSA上的作用部位均為SiteⅡ，即HSA的亞域ⅢA，與分子對(duì)接結(jié)果相吻合。

2.2.6 IPC－PFFA－3與HSA的作用力類型 有機(jī)物小分子和生物大分子如蛋白質(zhì)等之間的作用類型主要有靜電引力、范德華力、疏水作用力和氫鍵等。不同的有機(jī)物小分子和蛋白質(zhì)之間結(jié)合的作用力類型不同［23］。計(jì)算不同溫度下(291，298，310 K)，IPC－PFFA－3與HSA相互作用時(shí)的體系熱力學(xué)參數(shù)結(jié)果，見表2。該體系ΔG＜0，說明IPC－PFFA－3與HSA的相互作用是自發(fā)進(jìn)行的，而ΔH＜0，ΔS＜0則表明二者作用力類型為氫鍵［24］，與分子對(duì)接結(jié)果相吻合。

表2 不同溫度下IPC－PFFA－3與HSA相互作用的熱力學(xué)常數(shù)Table 2 Thermodynamic parameters of IPC－PFFA－3－HSA interaction at different temperatures

3 結(jié)論

本文采用分子對(duì)接和動(dòng)力學(xué)模擬對(duì)IPC－PFFA－3與HSA的相互作用進(jìn)行理論推測(cè)，并通過光譜法進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)二者的結(jié)果進(jìn)行對(duì)照。結(jié)果表明，全氟丙酸小分子與HSA相互作用的方式為熒光猝滅作用，猝滅方式為靜態(tài)猝滅。熱力學(xué)常數(shù)的計(jì)算與分子對(duì)接結(jié)果得出二者間的主要作用力為氫鍵作用力。同步熒光光譜和動(dòng)力學(xué)模擬的結(jié)果表明二者間的結(jié)合十分穩(wěn)定，并使HSA的構(gòu)象發(fā)生了改變，毒理作用體現(xiàn)在HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，回旋半徑的變大足以說明HSA體系變得膨脹，其二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變正是由于小分子進(jìn)入HSA后對(duì)其產(chǎn)生的毒副作用所致，而結(jié)合力體現(xiàn)在相對(duì)初始結(jié)構(gòu)偏差RMSD值的改變，RMSD波動(dòng)變小說明這兩者的結(jié)合趨于穩(wěn)定。競(jìng)爭實(shí)驗(yàn)和分子對(duì)接、動(dòng)力學(xué)模擬的結(jié)果則證明全氟丙酸與HSA的結(jié)合位點(diǎn)位于SiteⅡ，說明IPC－PFFA－3對(duì)HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響進(jìn)而改變HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與理論推測(cè)相互驗(yàn)證，提高了實(shí)驗(yàn)分析的準(zhǔn)確度，為今后進(jìn)一步探究全氟化合物的毒性機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

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