人表皮生長因子的原核優(yōu)勢表達與復(fù)性

孫衛(wèi)國，楊栗坤，熊志紅，楊秉芬，劉艷華，張靈霞

解放軍第309醫(yī)院 結(jié)核病研究所，全軍結(jié)核病防治重點實驗室，北京 100091

人表皮生長因子（human epidermal growth factor，hEGF）是由53 個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，廣泛存在于人體各種組織內(nèi)。人體內(nèi)EGF含量不足易導(dǎo)致一系列的病理變化，如胃腸道潰瘍病，而補充外源性EGF 能大大縮短慢性胃潰瘍的療程[1]。EGF表達過量增加鳥氨酸脫羧酶的活性及多胺水平，也與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[2]。hEGF能促進燒傷、創(chuàng)傷及外科傷口的愈合，在燒傷、創(chuàng)傷、皮膚和角膜移植、外傷性皮膚潰瘍等治療中有重要作用。EGF也是某些化妝品的添加劑，具有較大的市場價值。目前利用原核系統(tǒng)表達重組hEGF（rhEGF）的主要弊端是表達量較低，生物活性不高，很難規(guī)?；a(chǎn)。我們根據(jù)原核表達系統(tǒng)特點，優(yōu)化影響rhEGF表達量的諸多因素，對基因核酸序列的mRNA 結(jié)構(gòu)、密碼子偏愛性，表達宿主菌的生長狀態(tài)進行綜合考慮，通過同義密碼子置換合成hEGF 全基因序列，構(gòu)建原核表達載體pET-24b-hEGF，獲得hEGF 在原核系統(tǒng)內(nèi)的高表達，其表達量占菌體總蛋白的15%左右。經(jīng)過復(fù)性條件的優(yōu)化，包涵體的復(fù)性率達90%以上，為原核系統(tǒng)規(guī)?；a(chǎn)rhEGF打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c3T3 細胞，大腸桿菌BL21（DE3）和載體pET24b 由本室保存；EGF 標準品由中國藥品生物制品檢定所提供；優(yōu)化后的hEGF編碼序列和測序由北京華大基因生物工程公司合成；酵母提取物、胰蛋白胨購自O(shè)xoid 公司；hEGF 抗體購自ABcam 公司；酶標羊抗兔IgG（HRP 標記）購自中杉生物工程技術(shù)公司；MTT 購自Sigma 公司；親和色譜填料購自GE 公司；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 hEGF全基因序列優(yōu)化與合成

根據(jù)生物軟件對hEGF可能表達量的預(yù)測，對其編碼序列按同義密碼子進行全合成，使mRNA 的二級結(jié)構(gòu)自由能滿足最優(yōu)表達需要，同時3′端加入大腸桿菌偏好終止密碼子TAA。合成的全序列為：AACAGCGACTCTGAATGCCCGCTGTCCCACGATGGTTACTGCCT GCATGATGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTATG CATGCAACTGCGTTGTTGGCTACATCGGTGAGCGTTGCCAGTAC CGTGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGC。

1.3 hEGF基因克隆與表達

對合成的含有hEGF 全序列載體pUC-hEGF 以限制性內(nèi)切酶NdeⅠ/XhoⅠ于37℃酶切10 h，瓊脂糖膠回收酶切后小片段，與經(jīng)同樣雙酶切的表達載體pET-24b 在T4DNA 連接酶的作用下于16℃連接4 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3）后，挑選陽性克隆測序，取測序結(jié)果同預(yù)期結(jié)果完全一致的菌落保存。將攜帶有hEGF 序列的原核表達載體命名為pET-24b-hEGF。

將陽性菌落接種含卡那霉素的LB 培養(yǎng)基，37℃振搖過夜活化后，按1∶100 的比例重新接種LB 培養(yǎng)基，檢測細菌的生長密度，當菌液D600nm達0.4 時，加入IPTG 使其終濃度為0.3 mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達7 h，離心收集沉淀菌體，加入PBS緩沖液混勻，冰浴超聲波破碎，表達菌液加入5×上樣緩沖液，煮沸后取20 μL 進行20% SDS-PAGE，分析目的蛋白在原核系統(tǒng)內(nèi)的表達量和表達形式。

1.4 rhEGF包涵體的復(fù)性與純化

電泳鑒定rhEGF 在原核系統(tǒng)中以包涵體的形式生成，對包涵體進行初步純化。收集rhEGF 沉淀包涵體，用1%的Triton X-100 洗滌3 次，4℃、5000 r/min 離心10 min；室溫條件下取rhEGF 包涵體，以含8 mol/L 尿素的Tris 緩沖液（50 mmol/L，pH8.8）溶解，高速離心后取溶液上清過Q Sepharose Fastflow陰離子交換柱，并用含8 mol/L 尿素的Tris 緩沖液（50 mmol/L，pH8.8）+NaCl 進行梯度洗脫，分別收集穿過峰和各洗脫峰蛋白；采用透析復(fù)性的方法對rhEGF 包涵體進行復(fù)性，將純化的包涵體尿素溶液以含5 mmol/L EDTA、0.1 mmol/L GSH、0.1 mmol/L GSSG 的Tris 緩沖液（50 mmol/L，pH8.8）在4℃條件下以1∶20 的體積進行透析，12 h 更換透析液一次，透析5 次后以50 mmol/L Tris 緩沖液（pH8.8）透析，整個透析過程均沒有沉淀產(chǎn)生；取透析后復(fù)性的rhEGF進行SDS-PAGE分析。

1.5 rhEGF的Western印跡與活性檢測

取純化的rhEGF 行20%的SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移后將硝酸纖維素膜（NC 膜）置于含5%脫脂奶粉的PBS 緩沖液中，室溫封閉1 h，用TBST 漂洗3 次；將NC 膜與兔抗hEGF 抗體（1∶3000 稀釋）于4℃孵育過夜，用TBST 洗滌3 次，再與適當稀釋的酶標記的羊抗兔二抗于37℃反應(yīng)1 h，用TBST 洗滌4 次；ECL 暗室中自動曝光顯影，驗證重組蛋白的抗原性。

BALB/c3T3 細胞用RPM1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，將對數(shù)生長期的細胞按7×103/孔加入96 孔細胞培養(yǎng)板，24 h 后更換成含0.5%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，依次加入用維持培養(yǎng)液稀釋的不同濃度的EGF，每濃度梯度做3 個平行孔，37℃、5% CO2培養(yǎng)48～72 h，MTT 法檢測各孔的D490nm值，繪制D490nm-EGF濃度關(guān)系圖[3]。

2 結(jié)果

2.1 hEGF原核表達載體構(gòu)建

對含有hEGF 全序列的載體pUC-hEGF 進行擴增后用NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切，回收酶切后的小片段，通過連接酶克隆到表達載體pET-24b 中，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒pET-24b-hEGF，經(jīng)NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定，10 g/L 瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，酶切后生成的條帶位于目標大小160 bp處（圖1）。

2.2 rhEGF的原核表達

取測序正確的含有質(zhì)粒pET-24b-hEGF 的重組大腸桿菌BL21（DE3）接種含卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)，在菌液D600nm值約為0.4 時加入IPTG誘導(dǎo)表達7 h，離心收集沉淀，超聲波破碎，20%SDS-PAGE 分析目的蛋白的表達量和表達形式。結(jié)果如圖2，在相對分子質(zhì)量6×103處，誘導(dǎo)后有rhEGF明顯表達，其表達量占總蛋白的15%以上，且基本以包涵體的形式存在于超聲波后的沉淀中。

2.3 rhEGF包涵體的復(fù)性與純化

圖1 pET-24b-hEGF雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖電泳

對表達的rhEGF 包涵體用Triton X-100 洗滌，除去脂類和降解的核酸，然后分別用2、4、6、8 mol/L的尿素溶解。SDS-PAGE 檢測發(fā)現(xiàn)，在6 mol/L 的尿素溶液里rhEGF 包涵體得到部分溶解，而在8 mol/L的尿素溶液里全部溶解。取變性后的上清液過Q Sepharose Fastflow 陰離子交換柱，用含8 mol/L 尿素的Tris緩沖液（50 mmol/L，pH8.8）+NaCl進行梯度洗脫。當鹽濃度為0.4 mol/L 時洗脫目的蛋白，一步純化的純度達90%以上。對洗脫上清透析復(fù)性，整個透析過程均沒有沉淀產(chǎn)生，復(fù)性率達90%以上。取復(fù)性的rhEGF 經(jīng)SDS-PAGE 分析純度，結(jié)果如圖3，純化復(fù)性后rhEGF的Image軟件掃描純度可達93%。

2.4 rhEGF的Western印跡與活性分析

取純化的rhEGF，經(jīng)SDS-PAGE 后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，分別和相應(yīng)的一抗和二抗孵育、洗滌。與ECL 結(jié)合1 min，暗室曝光顯影，結(jié)果如圖4，純化的rhEGF能與其抗體結(jié)合，具有強的抗原性。

用BALB/c3T3 細胞通過MTT 增殖法測定rhEGF的活性，以生物制品檢定所提供的EGF為陽性對照，陰性對照為培養(yǎng)液，細胞接種數(shù)為7×103/孔。結(jié)果如圖5，rhEGF 活性約為2.5×106U/mL。20～160 ng/mL 的rhEGF 對成纖維細胞具有明顯的促增殖作用，與標準品表現(xiàn)一致，兩者在統(tǒng)計學(xué)分析上無差異。

3 討論

圖2 hEGF原核表達形式的SDS-PAGE分析

圖3 rhEGF純化后的SDS-PAGE分析

圖4 rhEGF的Western印跡

圖5 rhEGF對BALB/c3T3細胞的促增殖作用

諸多因素影響外源基因在原核系統(tǒng)中的表達效率，如外源基因結(jié)構(gòu)、密碼子偏性、mRNA 翻譯起始區(qū)結(jié)構(gòu)，目的蛋白的毒性、氨基酸組成，表達條件的優(yōu)化等[4]。成熟hEGF 具有廣泛的生理功能，如加速受傷表皮細胞的修復(fù)和治療胃腸道潰瘍等[5]。目前用原核表達系統(tǒng)生產(chǎn)rhEGF 的表達量非常低。Ferrer-Soler等利用pET-22b載體獲得了單體rhEGF，但表達量很低[6]。為了獲得EGF 單體的高表達量，可對其氨基酸密碼子進行同義置換，改變其mRNA 序列自由能，使其適合原核表達系統(tǒng)的特點。我們采用生物信息學(xué)方法，參照生物軟件Vector NTI Suitor 7.0 對hEGF 核酸序列進行分析和合成，實現(xiàn)其在原核系統(tǒng)內(nèi)的優(yōu)勢表達，表達量約占菌體總蛋白的15%；同時，對rhEGF 包涵體的復(fù)性進行了摸索研究，使包涵體的復(fù)性率達到90%以上。本實驗為進一步研究hEGF的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)，也可為獲得重組蛋白在原核系統(tǒng)的高表達提供借鑒和參考。

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[3]鄭敏,嚴莉,黃清松.EGF 在比赤酵母中的表達及活性測定[J].解剖學(xué)研究,2013,35(1):36-38.

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[6]Ferrer-Soler L,Cedano J,Querol E,et al.Cloning,expression and purification of human epidermal growth factor using different expression systems[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2003,788:113-123.