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    血小板衍生生長因子BB亞型在畢赤酵母中的表達及純化

    2015-11-29 08:31:38房婷張曉鵬章晟戴萌萌楊秀旭付玲于長明
    生物技術(shù)通訊 2015年5期
    關(guān)鍵詞:畢赤酵母克隆

    房婷 ,張曉鵬,章晟,戴萌萌,楊秀旭,付玲,于長明

    1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院科學(xué)院 生物工程研究所,北京 100071;2.北京軍區(qū)總醫(yī)院 附屬八一兒童醫(yī)院,北京 100700

    血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)是一種耐熱、耐酸及易被胰蛋白酶水解的陽離子糖蛋白,主要由成熟的血小板分泌,1974年由Ross 等首先從血小板中獲得[1]。PDGF 作為一種有絲分裂促進劑,可以刺激成纖維細胞和平滑肌細胞的分裂和趨化功能、促進巨噬細胞產(chǎn)生和分泌生長因子,在胚胎發(fā)生、創(chuàng)傷愈合、動脈硬化及惡性腫瘤等體內(nèi)多個病理、生理過程中均發(fā)揮重要作用,尤其在創(chuàng)傷愈合方面作用更為顯著[2-8]。PDGF 是陽離子糖蛋白,相對分子質(zhì)量為28×103~35×103,等電點為9.8,由A、B 兩條肽鏈通過二硫鍵構(gòu)成同型或異型的二聚體[9]。PDGF 家族有5 個亞型,即PDGF-A(AA)、PDGF-B(AB 和BB)、PDGF-C(CC)和PDGFD(DD)[10];5 個亞型通過2 種特異性受體(PDGF receptor,PDGFR)α和β調(diào)節(jié)多種細胞功能[11]。

    重組人PDGF-BB(rhPDGF-BB)的相關(guān)研究展現(xiàn)出良好的臨床應(yīng)用前景,受到廣泛關(guān)注[12]。1997年美國FDA 批準Regranex 上市,用于慢性糖尿病引發(fā)的神經(jīng)性潰瘍的治療,其活性成分就是釀酒酵母表達的0.01%的rhPDGF-BB。N 端氨基酸分析表明,從人血小板提取物中分離純化的PDGF-BB 存在3 種不同的剪切形式,即20%的Ser1、45%的Thr6 及35%的Thr33,這些切割的異質(zhì)性導(dǎo)致PDGF 的不均一性[13]。釀酒酵母表達的109 個氨基酸的重組PDGF-BB,N 端氨基酸序列同樣存在2 種形式,即109 個氨基酸的全長B 鏈和104 個氨基酸的缺失B鏈Thr6-PDGF-BB,使得PDGF-BB 的精確質(zhì)量控制較困難,而且104個氨基酸的B 鏈蛋白保持與109個氨基酸同樣的生物學(xué)活性[14]。

    在本研究中,我們采用巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統(tǒng),構(gòu)建了104個氨基酸的PDGF-BB基因,并進行了高密度發(fā)酵培養(yǎng),利用三步層析對發(fā)酵上清進行純化,并對蛋白進行初步鑒定和生物學(xué)活性測定,獲得了適于畢赤酵母表達系統(tǒng)的、適度糖基化且純度和生物學(xué)活性符合要求的rhPDGF-BB。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    人早幼粒白血病細胞系HL-60 細胞為本室保存;BALB/c 小鼠3T3 細胞株購自中國藥品生物制品檢定所;畢赤酵母GS115、大腸桿菌DH5α由本室保存;pMEX9K由本實驗室構(gòu)建并保存。

    限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶購自Promega 公司;TRIzol 總RNA 提取試劑盒為Gibco 公司產(chǎn)品;低分子量蛋白標準購自Sigma 公司;YNB 為Difico 公司產(chǎn)品;PDGF-BB 國際標準品IS94/728 購自英國國家生物制品檢定所(NIBSC);PVDF 膜為Millipore 公司產(chǎn)品;PDGF-B(F-3)抗體為Santa Cruz Biotechnology 公司產(chǎn)品;二抗Anti-mouse IgG、HRP-linked Antibody 為Cell Signaling Technology 公司產(chǎn)品;層析介質(zhì)Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(High Sub)、Source 30S、Superdex 75 prep grade 購 自GE Healthcare公司。

    1.2 目的基因的獲得

    采用TRIzol 試劑盒從人早幼粒白血病細胞系HL-60 細胞中提取總RNA。以提取的RNA 為模板進行RT-PCR,正向引物為5'-CCGCTCGAG(XhoⅠ)AAAAGAACCATTGCTGAGCCGGCCA-3',反向引物為5'-GGAATTC(EcoRⅠ)TTAGGTCACAGGCCGT-3',引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    50 μL 反應(yīng)體系:AMV/Tf15×緩沖液10 μL,dNTP 1 mmol/L,MgSO4(50 mmol/L)1 μL,上、下游引物各50 pmol,AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶5 U,Tf1DNA 聚合酶5 U,總RNA 50 ng。反應(yīng)條件:48℃逆轉(zhuǎn)錄45 min,94℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶2 min,然后以94℃變性30 s、60℃復(fù)性30 s、72℃延伸40 s進行35個循環(huán),最后72℃總延伸7 min。回收PCR 產(chǎn)物。

    1.3 表達載體的構(gòu)建

    將回收獲得的目的基因片段與分泌型酵母表達載體pMEX9K 片段按照分子摩爾比>3∶1 的比例構(gòu)建連接體系,用T4DNA 連接酶連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)菌株,隨機挑取若干轉(zhuǎn)化后的克隆進行菌類PCR 鑒定,鑒定為陽性的克隆提取質(zhì)粒后委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

    1.4 電轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒DNA至酵母感受態(tài)細胞

    將鑒定為陽性的pMEX9k-PDGF-B 克隆接種至LB(含氨芐西林)培養(yǎng)基中,37℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜,次日提取重組質(zhì)粒,用SalⅠ-HF 酶線性化,電轉(zhuǎn)化至酵母菌株GS115 中,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布MD 平板,篩選得到his+重組克隆,隨機挑取若干重組克隆進行菌類PCR 鑒定,鑒定為陽性的克隆提取質(zhì)粒后委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

    1.5 高表達菌株的篩選

    由于pMEX9K 載體具有G418 抗性,因此取his+重組克隆涂布在不同G418濃度的YPD平板上,用于篩選多拷貝插入子。分別取200 μL 細胞懸液涂于平板上,G418 終濃度為0.25、0.5、1.0 和2.0 mg/mL,30℃培養(yǎng)2~3 d,篩選具有高G418抗性、且生長良好的菌株作為表達菌株。分別挑取單克隆接種于5 mL BMGY 培養(yǎng)基中,30℃、250 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜,室溫3000 r/min離心5 min,棄上清,用BMMY重懸菌體,30℃、250 r/min 振蕩誘導(dǎo)表達,每24 h 補加甲醇至0.5%,誘導(dǎo)72 h 后,室溫8000 r/min 離心20 min 收集上清。非還原SDS-PAGE 檢測各克隆表達情況,選取目的蛋白(相對分子質(zhì)量約30×103條帶)表達量高的菌株,測定表達上清的蛋白濃度(Lowrry法,見2010 年版《中華人民共和國藥典》(三部)附錄ⅥB 第二法),并對非還原SDS-PAGE 的結(jié)果掃描進行灰度分析。

    1.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達

    用BMGY/BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)蛋白表達。挑取新鮮平板上單菌落到裝有25 mL BMGY 培養(yǎng)基的250 mL 搖瓶中,28~30℃、250 r/min 振蕩培養(yǎng)至D600nm為2~6(16~18 h)。將25 mL 過夜培養(yǎng)物接種至含1 L BMGY 培養(yǎng)基的5 L 搖瓶中,28~30℃、250 r/min 繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期(D600nm為2~6),離心收集菌體。去除原培養(yǎng)基,用1 L BMMY 培養(yǎng)基重懸酵母細胞,28℃、250 r/min 開始誘導(dǎo)表達,每隔24 h 添加甲醇至終濃度為0.5%,誘導(dǎo)表達72 h 后,8000 r/min離心20 min,收集酵母表達上清。

    1.7 重組蛋白的純化

    1.7.1 Phenyl HS 疏水層析 表達上清用1/2 體積的調(diào)節(jié)緩沖液[60 mmol/L PB,3 mol/L(NH4)2SO4,pH7.2]調(diào)節(jié)電導(dǎo),8000 r/min 離心20 min,上樣于用20 mmol/L PB、1 mol/L(NH4)2SO4(pH7.2)溶液平衡好的Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(High Sub)疏水層析柱,上樣結(jié)束后,用20 mmol/L PB、1 mol/L(NH4)2SO4(pH7.2)的溶液再平衡,重組蛋白用洗脫液(20 mmol/L PB,50%乙二醇,pH7.2)洗脫,收集目的蛋白峰。

    1.7.2 Source 30S 離子層析 用平衡緩沖液(20 mmol/L PB,pH7.2)稀釋Phenyl HS 洗脫峰至電導(dǎo)值為6 ms/cm 以下,直接上樣于用平衡緩沖液平衡好的Source 30S離子層析柱,用20 mmol/L PB、1 mol/L NaCl(pH7.2)梯度洗脫,收集目的蛋白。

    1.7.3 Superdex 75 凝膠層析 目的蛋白峰用0.45 μm 孔徑的濾膜過濾后,用Superloop 分次上樣,每次上樣體積不超過柱體積的3%。采用Hiload Superdex 75 pg 凝膠濾裝柱,平衡液為20 mmol/L PB、0.15 mol/L NaCl(pH7.2),一步法收集洗脫峰。

    1.8 重組蛋白的鑒定和活性測定

    將純化的rhPDGF-BB 進行還原及非還原SDSPAGE,分離膠濃度為15%,上樣量分別為10 和2 μg。Western 印跡條件:15% SDS-PAGE,電轉(zhuǎn)條件為300 mA 穩(wěn)流1 h,將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF 膜上,抗PDGF-B 的一抗按1∶1000 稀釋,二抗按1∶10000 用封閉液稀釋。采用Edman 化學(xué)降解法測定N 端前5個氨基酸序列。

    采用BALB/c 小鼠3T3 細胞株/MTT 法測定純化后的rhPDGF-BB 生物活性。具體方法如下:取對數(shù)生長期的BALB/C 3T3 細胞,計數(shù)后以測定培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度至1×105/mL,接種于96 孔細胞培養(yǎng)板,每孔100 μL,37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)18~24 h。取PDGF-BB 國際標準品,以無血清DMEM 培養(yǎng)液溶解并稀釋至40 U/mL,同法稀釋待測樣品,將已預(yù)稀釋的參考品和待測樣品于96 孔板上用無血清DMEM 培養(yǎng)液進行倍比梯度稀釋,共做12 梯度濃度,每一梯度設(shè)2 個復(fù)孔;將梯度稀釋好的參考品和待測樣品每孔加入100 μL至已接種BALB/c 3T3細胞的96 孔細胞培養(yǎng)板中,37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)64~72 h。加入MTT 溶液,培養(yǎng)5 h 后加入DMSO 裂解液,室溫放置30 min 后比色,測定D510nm值,計算rhPDGF-BB的生物活性。

    實驗數(shù)據(jù)采用四參數(shù)回歸計算法進行處理。

    2 結(jié)果

    2.1 目的基因的獲得和酵母表達株的構(gòu)建

    RT-PCR 一步法獲得目的基因312 bp,命名為PGBF-BB,經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳分析,目的條帶大小正確(圖1),與本室保存的pMEX9K 載體[14]連接構(gòu)建pMEX9K-PGBF-B 表達連接載體。pMEX9K由畢赤酵母蛋白表達專用載體pPIC9K 改構(gòu)而來,通過AXO1(alochol oxidase,乙醇氧化酶)啟動子調(diào)控外源蛋白的表達,并且有由α交配因子(α-factor)分泌的信號序列引導(dǎo)外源蛋白分泌表達。鑒定為陽性的表達載體經(jīng)SalⅠ酶線性化后電轉(zhuǎn)化受體菌GS115,得到his+重組克隆。PCR 法鑒定重組克隆,檢測引物為5'AXO1引物和3'AXO1引物,結(jié)果(圖2)為2 條帶,一條為約2.2 kb 的野生型AXO1基因,另一條為789 bp 的含目的基因的片段,其中目的基因312 bp,AXO1基因側(cè)翼序列長480 bp。

    2.2 高表達株的篩選

    pMEX9K載體賦予重組克隆對G418的抗性,而這種抗性的水平與整合入酵母基因組中載體的拷貝數(shù)呈正相關(guān)[15]。經(jīng)過4 輪篩選,最終在含有2.0 mg/mL G418 的YPD 平板上篩選到6 個克隆,將重組克隆進行誘導(dǎo)表達,15% SDS-PAGE 顯示(圖3)發(fā)酵上清中主要為目的蛋白條帶,可見重組蛋白為分泌表達;2.0 mg/mL G418 平板的重組克隆經(jīng)誘導(dǎo)后重組蛋白的表達量最高,振蕩培養(yǎng)后加甘油凍存作為發(fā)酵用種子。

    2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達

    圖1 RT-PCR擴增PDGF-BB基因

    圖2 菌落PCR結(jié)果

    畢赤酵母是甲醇營養(yǎng)型酵母,可利用甲醇作為其惟一碳源。在代謝甲醇的過程中,由于相關(guān)酶的結(jié)合效率低,使得畢赤酵母代償性地產(chǎn)生大量的酶,而調(diào)控該酶的啟動子也正是驅(qū)動外源基因在畢赤酵母中表達的啟動子。因此,通過BMGY 培養(yǎng)基增菌過程及更換BMMY 培養(yǎng)基誘導(dǎo)蛋白表達,在每個時間點取樣,SDS-PAGE 分析目的蛋白在發(fā)酵上清中的表達情況,結(jié)果見圖4。隨著誘導(dǎo)時間的增加表達量逐漸升高,48 和72 h 差異不明顯,72 h 時表達量最高,且很據(jù)蛋白濃度測定和BandScan 灰度掃描結(jié)果計算,目的蛋白的表達量高于100 μg/mL。

    2.4 PDGF-BB的純化

    發(fā)酵上清調(diào)節(jié)電導(dǎo)后先經(jīng)Phenyl HS 捕獲,通過一步洗脫將目的蛋白有效富集,同時去除了大部分發(fā)酵培養(yǎng)基中的色素和其他雜蛋白(圖5);第二步為Source 30S,此步基于目的蛋白與雜蛋白離子性質(zhì)的不同,同時由于該填料粒徑較小、分布均勻具有很高的分辨率,通過進一步的梯度洗脫可將絕大部分雜蛋白和剩余色素去除,同時將目的蛋白進一步富集濃縮(圖6);最后通過Superdex 75 凝膠過濾柱進行精細純化,去除痕量雜質(zhì)并完成緩沖液置換(圖7)。

    2.5 PDGF-BB的鑒定和活性測定

    圖3 高拷貝篩選后蛋白表達水平結(jié)果

    圖4 PDGF-BB不同誘導(dǎo)時間的SDS-PAGD圖

    非還原及還原SDS-PAGE 結(jié)果(圖8A)掃描后經(jīng)BandScan 5.0 軟件分析顯示,獲得的目的蛋白為同源二聚體形式,純度大于95%,單體形式表觀相對分子質(zhì)量約為14.5×103。Western 印跡結(jié)果(圖8B)表明目的蛋白能特異地與一抗結(jié)合,而陰性對照菌株和未經(jīng)誘導(dǎo)表達菌株的發(fā)酵上清均無陽性條帶。N 端測序結(jié)果見圖9,前5 個氨基酸殘基為T-I-AE-P,與理論一致,說明該重組蛋白N 端加工正確,未發(fā)生不正確剪切。Lowrry 法測定的PDGF-BB 濃度為3.21 mg/mL,采用BALB/c 3T3 細胞株/MTT 法測定的純化后目的蛋白的活性為1.61×106IU/mL,比活為5.0×105IU/mg(圖10)。

    圖5 Phenyl HS層析結(jié)果圖

    圖6 Source 30S層析結(jié)果圖

    3 討論

    畢赤酵母表達系統(tǒng)是20 世紀80~90 年代發(fā)展起來的極具潛力的酵母表達系統(tǒng)[17],利用該系統(tǒng)已成功表達了幾百種酶、藥用和疫苗用蛋白[18]。該系統(tǒng)具有許多其他蛋白表達系統(tǒng)所不具備的優(yōu)點,如可進行高密度發(fā)酵培養(yǎng),培養(yǎng)基成分簡單、廉價、適于工業(yè)化生產(chǎn),外源基因不易丟失,表達量高,許多蛋白甚至可達每升克級以上[19],作為真核表達系統(tǒng),可對表達的蛋白進行翻譯后正確加工和修飾,即二硫鍵的形成、蛋白的磷酸化、折疊、信號序列的加工和糖基化,而且不會像釀酒酵母產(chǎn)生超糖基化[20]。PDGF 已在多種系統(tǒng)中成功表達,如大腸桿菌[21]、釀酒酵母[14]、CHO 真核細胞[22]等,但具有如大腸桿菌表達為包含體、需要復(fù)性;釀酒酵母表達量低、難以量產(chǎn);CHO系統(tǒng)成本高昂、生產(chǎn)周期長等缺點。

    圖7 Superdex 75層析結(jié)果圖

    圖8 PDGF-BB蛋白SDS-PAGE(A)和Western印跡(B)分析

    我們用畢赤酵母系統(tǒng)以分泌形式表達rhPDGFBB,表達量可達每升百克級別,而且目的蛋白直接分泌到培養(yǎng)基中,不需復(fù)雜的破菌過程,且上清中雜蛋白含量很低,便于分離純化。通過三步實現(xiàn)了重組蛋白的高效純化,獲得了N 端整齊均一、純度和活性都符合要求的rhPDGF-BB 蛋白。綜上,我們利用畢赤酵母表達系統(tǒng)表達重組人PDGF-BB,表達產(chǎn)量高,成本低,工藝簡單,易于工業(yè)化放大,有良好的市場前景。

    圖9 PDGF-BB蛋白N端測序結(jié)果

    圖10 PDGF-BB蛋白的MTT法活性測定結(jié)果

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