涼血止癢合劑抗Ⅳ型變態(tài)反應的實驗研究

張旭楊瑾葉建州

（云南省中醫(yī)醫(yī)院皮膚科，昆明650000）

涼血止癢合劑抗Ⅳ型變態(tài)反應的實驗研究

張旭楊瑾葉建州*

（云南省中醫(yī)醫(yī)院皮膚科，昆明650000）

目的探討院內制劑涼血止癢合劑抗Ⅳ型變態(tài)反應的作用。方法采用2，4-二硝基氟苯（DNFB）造成變應性接觸性皮炎（ACD）動物模型和磷酸組胺所致豚鼠瘙癢實驗，探討涼血止癢合劑的抗Ⅳ型變態(tài)反應作用。結果涼止癢合劑對DNFB引起的小鼠耳廓腫脹有顯著的抑制作用，并有顯著提高磷酸組織胺致豚鼠局部皮膚瘙癢的致癢閾值的作用。結論涼止癢合劑具有抗Ⅳ型變態(tài)反應的作用。

Ⅳ型變態(tài)反應；涼血止癢合劑；動物實驗

Ⅳ型變態(tài)反應，亦稱為遲發(fā)型超敏反應（Delayed Type Hypersensitivity，DTH）引起的皮膚疾病包括接觸性皮炎、濕疹等［1］。涼血止癢合劑由云南省中醫(yī)醫(yī)院已故名老中醫(yī)劉復興主任自擬荊芩湯（紫草、生地黃、牡丹皮、赤芍、荊芥、枯黃芩）加入刺蒺藜、制首烏、生黃芪、九里光、昆明山海棠等化裁而來，具有清熱涼血、祛風止癢、養(yǎng)血活血作用，主要用于血熱型皮炎濕疹類皮膚病［2］。本文通過動物實驗，驗證該藥的抗Ⅳ型變態(tài)反應作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物昆明種小白鼠，清潔級，40只，雌雄各半，體重18～22 g。購自昆明醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（滇）2005-0008；合格證號：0013106。健康豚鼠，清潔級，30只，雌雄各半，購自昆明醫(yī)科大學動物室，許可證號：SCXK（滇）2005-0008；合格證號：0021861。

1.2 藥物涼血止癢合劑，滇藥制字（Z）20081880A，100ml/瓶，云南省中醫(yī)醫(yī)院院內制劑，由云南省中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供。醋酸地塞米松片，0.75 mg/片，浙江仙琚制藥股份公司，國藥準字：H33020822，批號：130644。

馬來酸氯苯那敏片（撲爾敏片）：4 mg/片，昆明振華制藥廠有限公司，批號：20130501。0.9%氯化鈉注射液，國藥準字H52020069，250 mL/瓶；貴州天地藥業(yè)有限責任公司出品，批號A13061504。

1.3 主要試劑及儀器磷酸組胺：成都艾科達化學試劑有限公司生產，批號：201305011，分析純。2，4-二硝基氟苯（DNFB）：武漢福鑫化工有限公司，批號：201206012，分析純。8 mm耳腫打耳器YLS-Q4，購自山東省醫(yī)學科學設備站。NewClassic MF電子分析天平：梅特勒-托利多（METTLER TOLEDO）公司生產。

1.4 給藥劑量涼血止癢合劑，生藥含量為79 g/100ml，經人和動物的等效劑量系數(shù)換算，標準體重小鼠給藥劑量為20.57 g/kg，標準體重豚鼠給藥劑量為12.25 g/ kg。醋酸地塞米松片，小鼠給藥劑量為0.01 g/kg［3］。撲爾敏片，豚鼠給藥劑量為24 mg/kg［4］。主要試劑配制，以4∶1的丙酮:橄欖油配成0.5%、0.2%兩種濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2 實驗方法

2.1 涼血止癢合劑對ACD動物模型影響

2.1.1 實驗動物分組、給藥與造模［5］健康昆明種小鼠，40只，雌雄各半，隨機（隨機數(shù)字表法）分成4組，分別為空白對照組，模型組，陽性對照組（醋酸地塞米松組），涼血止癢合劑組。除空白對照組、模型組給予等體積生理鹽水外，陽性藥組醋酸地塞米松組每日給藥量為0.01 g體重，按照人和動物的等效劑量系數(shù)計算，標準體重小鼠給藥劑量為20.57 g/kg，共給藥7 d［3］。實驗前一天在腹部固定部位3 cm×3 cm用剪刀及剃須刀去毛。實驗第1、2天致敏期于去毛部位涂0.5%DNFB，每天1次，每次20 μl，第3、4、5天不涂藥，第一次致敏后的第6天，用0.2%DNFB溶液20 μl涂抹在小鼠左耳兩面進行免疫攻擊。右耳單涂丙酮：橄欖油（4∶1）溶劑作為對照；涂耳24 h后處死，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑為8 mm的耳腫打耳器分別在兩耳相應部位打孔，電子天平稱重。

2.1.2 觀察指標計算誘發(fā)后左右耳組織塊重量之差。

耳重量：于誘發(fā)24 h后處死，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑8 mm的耳腫打耳器在耳中部打孔，取下相同大小的組織塊，稱取其重量。用分析天平稱得每個組織塊的重量。計算誘發(fā)后左右耳組織塊重量之差。

2.2 涼血止癢合劑對磷酸組織胺致癢作用的影響

2.2.1 目的了解涼血止癢合劑對磷酸組織胺致癢作用的影響。

2.2.2 分組、給藥、造模［6］與檢測指標豚鼠30只，雌雄各半，隨機（隨機數(shù)字表法）分為模型組，陽性對照組（撲爾敏組），涼血止癢合劑組。除模型組給予等體積生理鹽水外，陽性藥組給藥劑量為每日24 mg/kg，根據(jù)人和動物的等效劑量系數(shù)折算，涼血止癢合劑組給藥劑量為12.25 g/kg，連續(xù)用藥7 d［4］。于實驗前1h剪去右后足背毛，用細砂紙輕輕擦傷，使之發(fā)紅，但不出血為度，面積約2 mm2。各組灌胃給藥或生理鹽水30 min后，用0.01%磷酸組織胺0.05 mL/只，此后每隔3 min依0.02%、0.03%、0.04%……遞增濃度，每次均為0.05 mL/只，直至出現(xiàn)豚鼠回頭舔右后足背，以最后出現(xiàn)豚鼠回頭舔右后足背時所給予的磷酸組織胺總量（μg）為致癢閾值，記錄并比較各組的致癢閾值。

3 統(tǒng)計方法

使用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。計量資料均使用（x±s）表示。兩獨立樣本的計量資料比較若呈正態(tài)分布，并具有總體方差齊性，則采用t檢驗，若不具有總體方差齊性，則使用t’檢驗。兩組以上數(shù)據(jù)比較若具有總體方差齊性則采用單因素方差分析，多組數(shù)據(jù)間的兩兩比較使用Least-Signfieant-diffrne（LSD）方法；兩組以上數(shù)據(jù)比較若不具有總體方差齊性，則使用Kruskal-Wallis H秩和檢驗，兩兩比較使用Mann-Whitney U秩和檢驗。以上統(tǒng)計方法，均以P＜0.05為具有統(tǒng)計學意義。

4 實驗結果

4.1 涼血止癢合劑對ACD動物模型影響

表1 空白對照組與模型組耳片重量值的比較

表1 空白對照組與模型組耳片重量值的比較

注：經t’檢驗，與空白對照組比較，1）P=0.000＜0.05

組別例數(shù)耳片重量值（g）空白對照組100.0140±0.0019模型組100.0407±0.00481）

小鼠誘發(fā)皮炎后耳重量差的比較，見表2，模型組、陽性對照組和涼血止癢合劑組兩兩之間比較，具有統(tǒng)計學意義。

表2 涼血止癢合劑DNFB所致小鼠遲發(fā)型超敏反應的影響

表2 涼血止癢合劑DNFB所致小鼠遲發(fā)型超敏反應的影響

組別模型組陽性對照組涼血止癢合劑組例數(shù)10 10 10劑量（g/kg）-0.01 20.57給藥途徑耳片重量差值（g）i.g.0.0259±0.0047 i.g.0.0187±0.0074 i.g.0.0156±0.0069

經單因素方差分析，三組間比較，P=0.004＜0.05，說明三組間有顯著性差異；再使用LSD方法進行比較：（1）模型組與陽性對照組比較P=0.018＜0.05，說明兩組有統(tǒng)計學意義（2）模型組與涼血止癢合劑組比較P=0. 001＜0.05，說明兩組有統(tǒng)計學意義；（3）陽性對照組與涼血止癢合劑組比較P=0.295＞0.05，說明兩組間無統(tǒng)計學意義。

4.2 涼血止癢合劑對磷酸組織胺致癢作用的影響

表3 涂抹磷酸組織胺次數(shù)及累計用量（致癢閾）

表3 涂抹磷酸組織胺次數(shù)及累計用量（致癢閾）

組別模型組陽性對照組涼血止癢合劑組例數(shù)10 10 10劑量（g/kg）-0.002 12.25給藥途徑致癢閾（mg）i.g.52.0000±22.5093 i.g.91.5000±29.6320 i.g.98.0000±32.9309

經單因素方差分析，三組間比較，P=0.003＜0.05，說明三組間有統(tǒng)計學意義；再使用LSD方法進行比較：（1）模型組與陽性對照組對比P=0.005＜0.05，說明兩組有統(tǒng)計學意義；（2）模型組與涼血止癢合劑組比較P=0.001＜0.05，說明兩組有統(tǒng)計學意義；（3）陽性對照組與涼血止癢合劑組比較P=0.617＞0.0.5，說明兩組間無統(tǒng)計學意義。

5 討論

涼血止癢合劑和醋酸地塞米松連續(xù)灌胃給藥7天后，均對DNFB所致小鼠遲發(fā)型超敏反應有一定的抑制作用，兩組與模型組比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。涼血止癢合劑組和陽性對照組比較沒有統(tǒng)計學差異（P＞0.05），說明涼血止癢合劑與醋酸地塞米松片均具有抗炎作用。

涼血止癢合劑組和撲爾敏連續(xù)灌胃給藥7天后，均能明顯提高豚鼠致癢閾，兩組與模型組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明涼血止癢合劑與撲爾敏均具有拮抗外源性組織胺的作用。

Ⅳ型變態(tài)反應是由T細胞介導的針對皮膚接觸的抗原產生的遲發(fā)型變態(tài)反應（DTH）。實驗用DNFB建立小鼠ACD模型，從而引起Ⅳ型變態(tài)反應，把小鼠耳廓作為皮炎的靶部位，根據(jù)炎癥耳廓的厚度來判斷抗皮炎藥物的療效。實驗提示，涼血止癢合劑可以明顯抑制小鼠耳腫脹程度，推測其作用機理可能與調節(jié)細胞因子，減少T細胞的釋放，調節(jié)恢復免疫平衡有關，因而具有較明顯的抗Ⅳ型變態(tài)反應的作用。

瘙癢是變態(tài)反應性皮膚疾病常見癥狀之一，其發(fā)病機制研究尚不完全清楚，可能與諸多因素有關，有大量研究表明，組胺是一種可以引起皮膚瘙癢的重要介質［7］，主要儲存在嗜堿粒細胞和肥大細胞的顆粒內，由在組氨酸脫羧酶作用下的組氨酸脫羧而成。在臨床上作為治療靶點，組胺受體的H1、H2亞型已廣泛應用，H3、H4在近年來也先后被研發(fā)克?。?］。在組胺誘導瘙癢的過程中H1受體起到了重要作用，當組胺和H1受體相互作用時，可產生平滑肌收縮痙攣、毛細血管擴張、管壁通透性增加、腺體分泌增多等生理現(xiàn)象，因此H1受體被認為是過敏癥狀產生的靶點［9］。實驗采用外源性組胺誘發(fā)豚鼠瘙癢的方法，結果提示，涼血止癢合劑組和陽性藥組對組胺所致豚鼠局部的皮膚瘙癢均有抑制作用，與模型組比較，豚鼠局部致癢閾值明顯提高（P＜0.05）；故涼血止癢合劑有抗瘙癢的作用。推測涼血止癢合劑止癢的作用機制可能是：①抑制肥大細胞脫顆釋放組胺等炎癥介質；②產生了類似H1受體拮抗劑的作用，通過競爭與H1受體結合，從而抑制了組胺與靶點的相互作用，使其無法表達生理活性，進而達到抗過敏止癢的效果。

涼血止癢合劑具有較為明確的抗Ⅳ型變態(tài)反應的作用，但其確切的作用機理還有待進一步的研究。

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［3］陳奇.中藥藥理研究方法學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2011:28.

［4］趙杰，余林中，方芳，等.麻黃-甘草藥對的抗炎作用及機制研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（15）:164.

［5］張文平，陳惠群，張文書，等.四物湯抗炎止癢作用的實驗研究.時珍國醫(yī)國藥［J］，2006，17（9），1685-1686.

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［7］汪晨.慢性濕疹的治療［J］.中國全科醫(yī)學，2004，7（12）:856.

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葉天士巧治外孫天花

清代梁章鉅的《浪跡叢談續(xù)談三談》與徐珂的《清稗類鈔》都記載了一代名醫(yī)葉天士給自己外孫治病的奇聞逸事。

葉天士一外孫，剛滿一歲就染上了天花，痘閉不出，高熱昏迷，呼吸急迫。葉天士之女神色慌亂，抱著孩子回娘家，一生活人無算的父親成為她最后的希望。哪知葉天士一看到病怏怏的外孫，就感嘆太晚了。葉女很氣憤，以頭撞門，“父親您作為姑蘇城數(shù)一數(shù)二的名醫(yī)，曾經說過小兒痘疹沒有死證，難道只有您的外孫活不過今天嗎？女兒我只好先走一步了”。說完，又拿起一把剪刀，朝向自己的脖子刺去。葉天士不得已，承諾一定會盡力把孩子搶救過來，葉女這才放下了剪刀。葉天士坐在書桌旁，苦思冥想，終于想出了一個辦法。脫光孩子的衣服，放在一間閑置很久的空屋子里，就外出賭博去了。葉女想看看兒子到底怎么樣了，但是門上鎖了打不開，多次派下人督促父親趕緊回家，可是葉天士玩得正在興頭上，毫無歸意，葉女哭得死去活來。直到深夜，葉天士才回家，點上燈，開了鎖，看到外孫痘疹遍布全身，粒粒如珠，高熱已退。原來，此時正是三伏天，空屋子里蚊子嗡嗡叫個不停，接二連三叮咬孩子皮膚，痘疹發(fā)出來了。

——摘自《中國中醫(yī)藥報》

Experimental Study on Liangxue Zhiyang mixture against Delayed Type Hypersensitivity

ZHANG Xu，YANG Jin，YE Jianzhou.
（Department of Dermatology，Yunnan Hospital of Traditional Chinese Medicine，Kunming650000，China）

Objective To investigates the antiallergic and the anti-inflammatory function of Liangxue Zhiyang mixture.Methods Through ACD induced by DNFB and experiment of guinea pig pruritus induced by Histamine Phosphate，found the pharmacodynamic mechanism and function of Liangxue Zhiyang mixture.Results Liangxue Zhiyang mixture had effect on the treatment of mice ear-swollen induced by DNFB.Conclusion It indicates that Liangxue Zhiyang mixture with a good anti-allergic and anti-inflammatory function and anantipruritic effects through the animal experiments.

delayed type hypersensitivity；Liangxue Zhiyang mixture；animal experiment

10.3969/j.issn.1672-2779.2015.06.072

1672-2779（2015）-06-0142-03

楊杰 本文校對：楊杰

2015-03-02）

*通訊作者：kmyjz63@sina.com