ACE基因單核苷酸多態(tài)性與冠心病易感性的關(guān)聯(lián)性分析

吳 娟，賈一揚(yáng)，劉 特，周麗婷，孫 迪，徐 縉，李春艷，王樹(shù)越，于 雷，葉 琳

（1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院急診科，吉林 長(zhǎng)春 130033；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院放療科，吉林 長(zhǎng)春 130041）

冠心病 （coronary heart disease，CHD）是一種原因尚不明確的心血管疾病，其危險(xiǎn)因素主要包括遺傳因素、年齡、性別、血脂異常、高血壓、糖尿病、肥胖與超重、不良生活飲食習(xí)慣和精神壓力等。CHD的形成涉及到遺傳因素、環(huán)境因素及其交互作用，動(dòng)脈粥樣硬化是其病變的主要病理生理學(xué)機(jī)制［1－2］，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中腎素－血管 緊 張 素－醛 固 酮 系 統(tǒng) （renin－angiotensinaldosterone system，RAAS）起著重要的作用［3］。RAAS是體內(nèi)重要的內(nèi)分泌系統(tǒng)，在血壓及心血管穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中占有重要的地位，其過(guò)度激活與CHD、充血性心力衰竭和高血壓等疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［4］。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 （angiotensin converting enzyme，ACE）是RAAS系統(tǒng)中參與構(gòu)成血管內(nèi)皮細(xì)胞的一種金屬肽酶，是ACE基因的表達(dá)產(chǎn)物［5－6］。目 前國(guó)內(nèi)外 有關(guān) ACE 基 因 與CHD相關(guān)性的研究多集中于ACE基因插入／缺失多態(tài)性 （I／D）［7－9］，關(guān)于 ACE 基因單核苷酸多態(tài)性 （single nucleotide polymorphism，SNPs）與CHD關(guān)聯(lián)性的研究少有報(bào)道。本研究擬通過(guò)病例對(duì)照研究，選取ACE基因rs4267385和rs4316位點(diǎn)，旨在探討ACE基因與中國(guó)北方漢族人群CHD易感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2009—2013年在吉林大學(xué)第一醫(yī)院確診并住院治療的CHD患者246例作為病例組，研究對(duì)象臨床表現(xiàn)及心電圖變化均符合WHO制定的CHD診斷標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組為同期在吉林大學(xué)第一醫(yī)院體檢中心體檢的健康個(gè)體251名。個(gè)體間均無(wú)血緣關(guān)系且2組人群均為中國(guó)北方漢族人。

1.2 主要試劑和儀器 DNA提取試劑盒、TaqDNA聚合酶引物、PCR引物、限制性內(nèi)切酶、瓊脂糖和DL 2000DNA Marker（Takara公司，日本），溴化乙錠 （大連寶生物工程有限公司）。離心機(jī) （Eppendorf公司，德國(guó)），微量加樣器（Gilson公司，美國(guó)），PCR擴(kuò)增儀和紫外凝膠成像系統(tǒng) （Bio－Rad公司，美國(guó)），電泳儀 （北京六一儀器廠），恒溫培養(yǎng)箱 （上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.3 基因組DNA的提取 在研究對(duì)象知情同意的情況下，抽取外周靜脈血5mL，EDTA抗凝，－20℃凍存以備基因組DNA的提取。按照DNA提取試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟從EDTA抗凝全血中提取DNA，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA含量，A280／A260比值均在1.6～2.0。

1.4 SNPs的選擇 在Hapmap數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢中國(guó)北方漢族人群ACE基因的SNPs數(shù)據(jù)，運(yùn)用Haploview 4.2軟件對(duì)位點(diǎn)進(jìn)行篩選，選取最小等位基因頻率 （MAF）大于0.1、連鎖不平衡系數(shù) （r2）大于0.8、連鎖不平衡程度隨距離而改變的程度 （D′）為1的2個(gè)SNPs位點(diǎn) （rs4267385和rs4316）作為研究位點(diǎn)，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 （PCR－RFLP）方法進(jìn)行基因型檢測(cè)。

1.5 基因型檢測(cè) 引物設(shè)計(jì)：在NCBI的SNP庫(kù)里查詢ACE基因rs4267385和rs4316位點(diǎn)的模板序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。rs4267385，上游引物 5′－GGGAAGTGAGTCTGAGGG－3′，下游 引 物 5′－TGGAAGCCAGGTTATCTC－3′；rs4316，上 游 引 物 5′－CGGGCTCCGCTCTTATTG－3′， 下 游 引 物 5′－GGGCTCTGGGCTGATGTCT－3′。反應(yīng)體系為20μL，含有2×Taq PCR MasterMix 10μL，上下游引物各2μL，二餾滅菌水 （ddH2O）4μL，模板DNA 2μL；反應(yīng)條件：94℃ 預(yù) 變 性 5min；94℃、30s，58℃（rs4267385）／56℃ （rs4316）、30s，72℃、1min，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。酶切體系及反應(yīng)條件：酶切體系為20μL，包含PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μL，限制性內(nèi)切酶 （rs4267385用PmlⅠ，rs4316用 Xsp Ⅰ）0.8μL，ddH2O 7.2μL，10×Buffer／10×Buffer TangoTM2μL。酶切體系在37℃恒溫箱中酶切4～16h后，用2.5%瓊脂糖凝膠電泳30min，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察酶切圖譜，判斷位點(diǎn)的基因型。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)分析病例組和對(duì)照組基因型頻數(shù)分布是否符合Hardy－Weinberg平衡定律，采用χ2檢驗(yàn)分析SNPs基因型、等位基因頻數(shù)分布與CHD的關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié) 果

2.1 研究對(duì)象的基本情況 病例組共246例，其中男性130例，女性116例，平均年齡 （64.74±11.35）歲。對(duì)照組共251例，其中男性124例，女性127例，平均年齡 （62.39±12.16）歲。病例組與對(duì)照組研究對(duì)象年齡和性別比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t年齡＝1.614，P＝0.205；χ2性別＝0.150，P＝0.904），說(shuō)明病例組與對(duì)照組人群年齡和性別均匹配，具有可比性。

2.2 rs4267385和rs4316位點(diǎn)酶切電泳結(jié)果rs4267385位點(diǎn)帶有C基因型被酶切成336和52bp 2個(gè)片段；帶有T基因型不能被酶切，電泳時(shí)只有388bp片段；CT雜合子同時(shí)具有3個(gè)片段。rs4316位點(diǎn)帶有T基因型被酶切成140和116bp 2個(gè)片段；而帶有C基因型不能被酶切，電泳時(shí)只有256bp片段；CT雜合子同時(shí)具有3個(gè)片段。見(jiàn)圖1。

2.3 Hardy－Weinberg平衡定律檢測(cè) 采用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)對(duì)病例組和對(duì)照組rs4267385、rs4316位點(diǎn)的基因型頻數(shù)分布進(jìn)行Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)，結(jié)果顯示：病例組和對(duì)照組研究對(duì)象2個(gè)位點(diǎn)基因型分布均符合 Hardy－Weinberg平衡定律（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.4 病例組和對(duì)照組人群ACE基因rs4267385和rs4316位點(diǎn)的基因型和等位基因頻數(shù)分布比較病例組和對(duì)照組rs4267385位點(diǎn)CC、CT和TT基因型頻數(shù)分布比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），OR （CC／CT）＝0.660 （95%CI：0.398～1.118）， OR （TT／CT） ＝ 1.402 （95%CI：0.954～2.052），OR （CC＋ TT／CT） ＝1.139（95%CI：0.798～1.626）；C、T等位基因頻數(shù)分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），OR （C／T）＝0.640 （95%CI：0.495～0.827）。見(jiàn)表2。

圖1 rs4267385（A）和rs4316（B）位點(diǎn)酶切電泳圖Fig.1 Electrophoregram of digestion of rs4267385（A）and rs4316（B）sites

病例組和對(duì)照組rs4316位點(diǎn)CC、CT和TT基因型頻數(shù)分布比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）， OR （CC／CT） ＝ 0.926 （95%CI：0.581～1.475），OR （TT／CT）＝1.100（95%CI：0.717～1.686），OR （CC＋TT／CT）＝1.019（95%CI：0.715～1.454）；C、T等位基因頻數(shù)分布比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），OR （C／T）＝0.928 （95%CI：0.723～1.191）。見(jiàn)表3。

表1 2個(gè)SNPs位點(diǎn)Hardy－Weinberg平衡的擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results ofχ2 test of Hardy－Weinberg equilibrium of two SNPs sites

3 討 論

人體ACE基因位于染色體17q23，ACE對(duì)于心血管系統(tǒng)具有重要作用，主要使血管緊張素Ⅰ（AngiotensinⅠ，AngⅠ）轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ），滅活緩激肽和調(diào)節(jié)血管張力。AngⅡ有縮血管的作用，且能誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增生和肥厚，加強(qiáng)血小板衍生生長(zhǎng)因子的表達(dá)及抑制纖溶活性，使低密度脂蛋白 （LDL）在血管壁內(nèi)滯留、氧化并被巨噬細(xì)胞吞噬，促進(jìn)血栓形成；而緩激肽能刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放舒張因子，抑制平滑肌細(xì)胞的增殖［10］。當(dāng)ACE基因上某個(gè)堿基發(fā)生改變，可引起血管緊張素表達(dá)量或活性的改變，與冠心病和心肌梗死的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Sesal等［11］和 Dzielinska等［12］研 究 發(fā) 現(xiàn)：ACE 基因是歐洲人群中CHD的易感基因。YyLmaz等［13］對(duì)ACE基因I／D多態(tài)性與兒童CHD發(fā)病相關(guān)性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：病例組人群D等位基因頻數(shù)高于對(duì)照組。姜昕等［14］對(duì)中國(guó)居民ACE基因I／D多態(tài)性與CHD易感性關(guān)系進(jìn)行了薈萃分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：病例組人群DD基因型和D等位基因頻數(shù)分布均高于對(duì)照組，DD基因型個(gè)體CHD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高于ID型和II型，表明D等位基因與CHD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。

表2 病例組和對(duì)照組人群rs4267385位點(diǎn)基因型和等位基因頻數(shù)分布Tab.2 Distribution of genotypic and allelic frequencies at rs4267385site in case and control groups ［n （η／%）］

表3 病例組和對(duì)照組人群rs4316位點(diǎn)基因型和等位基因頻數(shù)分布Tab.3 Distribution of genotypic frequencies and allelic frequencies at rs4316site in case and control groups［n（η／%）］

CHD是一種受多個(gè)遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的復(fù)雜疾病。Sun等［15］研究發(fā)現(xiàn)：ACE基因rs4332位點(diǎn)多態(tài)性與老年人冠心病發(fā)病有關(guān)。Ellis等［16］對(duì)ACE基因多態(tài)性與CHD易感性的研究發(fā)現(xiàn)：ACE基因rs4267385多態(tài)性與CHD發(fā)病有關(guān)。本研究采用病例－對(duì)照研究探討ACE基因上2個(gè)SNPs與中國(guó)北方漢族人群CHD易感性的關(guān)系，結(jié)果顯示：病例組和對(duì)照組人群rs4267385位點(diǎn)基因型和等位基因頻數(shù)分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，OR （CC／CT）＝0.660、OR （TT／CT）＝1.402、OR （C／T）＝0.640，表明rs4267385位點(diǎn)多態(tài)性與中國(guó)北方漢族人群CHD易感性有關(guān)聯(lián)，TT基因型個(gè)體CHD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高于CC基因型和CT基因型個(gè)體，與Ellis等［16］研究結(jié)果一致。rs4267385位點(diǎn)多態(tài)性改變可能會(huì)導(dǎo)致ACE表達(dá)的差異，影響AngⅠ轉(zhuǎn)化為AngⅡ的過(guò)程，從而導(dǎo)致心血管疾病易感性的差異。本研究發(fā)現(xiàn)：rs4316位點(diǎn)多態(tài)性與中國(guó)北方漢族人群CHD易感性無(wú)關(guān)聯(lián)，可能是由于rs4316位點(diǎn)多態(tài)性與CHD易感性無(wú)關(guān)或本研究樣本量較少，檢驗(yàn)效能低的原故。在今后的研究中需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，同時(shí)檢測(cè)與CHD發(fā)生可能相關(guān)的其他基因，進(jìn)行基因與基因、基因與環(huán)境之間交互作用的分析。

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