MMP－2和MMP－9在食管鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織中的表達(dá)及其意義

孫曉宏，房福元，李 卉，尹 娜，龐作良，李惠武

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科，新疆 烏魯木齊 830011；2.廣東省深圳市人民醫(yī)院胸外科，廣東 深圳 518020；3.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院科研中心，新疆 烏魯木齊 830001）

食管癌是居于全球第8位的惡性腫瘤，在全球癌癥死亡原因中位列第6位。2008年，全球被診斷為食管癌患者482300例，有406800例死于食管 癌［1］。2003—2007 年 我 國(guó) 食 管 癌 發(fā) 病 率 為19.24／10萬(wàn)，在癌癥發(fā)病構(gòu)成中排列第6位，同期食管癌死亡率為15.39／10萬(wàn)，在癌癥死亡原因中列第4位［2］。中國(guó)食管癌發(fā)病占全球的53.8%，死亡占全球的51.9%［3］。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與細(xì)胞外基質(zhì) （extra cellular matrix，ECM）的降解有密切關(guān)聯(lián)［4］。ECM由多種蛋白裂解酶降解，其中包括基質(zhì)金屬蛋白酶 （matrix metalloproteinase，MMP）。國(guó)外鮮有關(guān)于MMP與食管癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究，國(guó)內(nèi)對(duì)于MMP的研究多采用免疫組織化學(xué)法，且多是單獨(dú)針對(duì)MMP中某一單一基因的研究。本研究應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （RTPCR）技術(shù)檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP－2）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP－9）基因在食管癌組織及其相應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá)情況，同時(shí)采用Western blotting技術(shù)在蛋白水平予以驗(yàn)證，從基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平探討兩者在食管癌發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用，闡明兩者之間的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2009年12月—2011年10月在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行食管癌根治性切除的100例患者的手術(shù)標(biāo)本，均為經(jīng)病理檢查證實(shí)的食管鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本，每例標(biāo)本分別取癌組織及其相應(yīng)癌旁組織各1份，于液氮冷凍后在－80℃冰箱儲(chǔ)存留待檢測(cè)。100例患者中，男性72例，女性28例；年齡37～80歲，中位年齡為57.4歲。食管癌TNM分期：T1＋T2期24例，T3＋T4期76例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者52例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者48例；高分化者77例，中、低分化者23例。

1.2 主要試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)所用Trizol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，PCR試劑盒購(gòu)自上海生物工程有限公司，溴化乙錠（EB）、瓊脂糖、氯仿、無(wú)水乙醇、異戊醇和異丙醇等由新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院科研中心提供；PCR擴(kuò)增儀和DC 2000凝膠成像分析儀為美國(guó)Bio－Rad公司生產(chǎn)。

1.3 RT－PCR法檢測(cè) MMP－2和 MMP－9mRNA 陽(yáng)性表達(dá)率

1.3.1 組織標(biāo)本中總RNA的提取及其濃度檢測(cè)

按照Trizol試劑盒的操作步驟提取組織標(biāo)本總RNA，于紫外分光光度計(jì)下分別測(cè)定提取的1μg RNA在260和280nm處的吸光度A260和A280值，計(jì)算A260／A280比值，使其在1.8～2.1以保證所提取的RNA的濃度和純度。取5μL RNA于1.2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，凝膠成像分析儀觀(guān)察提取的RNA 18S和28S條帶，確保所提RNA的質(zhì)量。

1.3.2 合成cDNA 在1μL總RNA標(biāo)本中分別加引物1μL和雙蒸水9μL，將其混勻后72℃恒溫溫浴10min后取出，將混合液置于冰上，依次加dNTP 2μL、MgCl24μL、RNA酶抑制劑0.5μL、10×緩沖液2μL和逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μL混勻，42℃恒溫1h，95℃恒溫5min，取出并放置在冰上，再加入雙蒸水80μL使最終逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物體積為100μL。

1.3.3 PCR反應(yīng) 向6μL雙蒸水中依次加入目的基因正、反向引物各1μL和2倍濃度的PCR試劑盒反應(yīng)液10μL，再加已合成的cDNA 2μL，使PCR反應(yīng)體系終體積為20μL。各基因引物序列、產(chǎn)物大小和PCR反應(yīng)溫度值見(jiàn)表1。

表1 MMP－2、MMP－9和GAPDH的引物序列和PCR反應(yīng)條件Tab.1 Primer sequences of MMP－2，MMP－9and GAPDH and reaction conditions of PCR

1.3.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的判定 于5μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物中加入緩沖液 （buffer）1μL后，行2%瓊脂糖凝膠電泳，在DC 2000凝膠成像分析儀下觀(guān)察目的基因條帶并保存圖像。在499bp附近出現(xiàn)亮色條帶，則 MMP－2表達(dá)陽(yáng)性，否則為陰性；在308bp附近出現(xiàn)亮色條帶，則MMP－9表達(dá)陽(yáng)性，否則為陰性。

1.4 Western blotting法檢測(cè) MMP－2和 MMP－9蛋白表達(dá)

選用Trizol法制備蛋白樣品，測(cè)定蛋白水平，電泳完畢后轉(zhuǎn)膜，然后封閉蛋白膜，分別加一抗孵育和二抗孵育，孵育結(jié)束后給予化學(xué)發(fā)光、顯影及定影，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的相對(duì)分子質(zhì)量和A值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。癌組織和癌旁正常組織中 MMP－2和 MMP－9陽(yáng)性表達(dá)率比較采用χ2檢驗(yàn)。MMP－2和MMP－9陽(yáng)性表達(dá)率的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 RT－PCR法檢測(cè)癌組織和癌旁正常組織中MMP－2mRNA 和 MMP－9mRNA 表達(dá)率

100例癌組織標(biāo)本中MMP－2mRNA陽(yáng)性表達(dá)率為 89.0% （89／100），對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中MMP－2mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率為76.0%（76／100），MMP－2mRNA在癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁正 常組織（χ2＝5.853，P＝0.016）；癌組織中MMP－9mRNA陽(yáng)性表達(dá)率為48.0% （48／100），對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中MMP－9mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率為16.0% （16／100），MMP－9mRNA 在癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁正常組織 （χ2＝23.529，P＝0.000）。見(jiàn)圖1。

圖1 癌組織和癌旁正常組織中 MMP－2mRNA和MMP－9 mRNA表達(dá)電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expreesions of MMP－2mRNA and MMP－9mRNA in tumor tissue and adjacent normal tissue

2.2 Western blotting法檢測(cè)癌組織和癌旁正常組織中MMP－2和MMP－9蛋白表達(dá)水平

隨機(jī)選取5例標(biāo)本，Western blotting檢測(cè)結(jié)果與對(duì)應(yīng)的RT－PCR檢測(cè)結(jié)果基本一致。見(jiàn)圖2。

2.3 不同臨床病理特征食管鱗狀細(xì)胞患者癌組織中 MMP－2和MMP－9mRNA陽(yáng)性表達(dá)率

MMP－2mRNA和 MMP－9mRNA陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)聯(lián) （P＜0.05），與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、患者的性別、年齡和腫瘤分化程度均無(wú)關(guān)聯(lián) （P＞0.05）。見(jiàn)表2。

圖2 癌組織和癌旁正常組織中MMP－2和 MMP－9蛋白表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of MMP－2and MMP－9proteins in tumor tissue and adjacent normal tissue

2.4 癌組織中 MMP－2mRNA 和 MMP－9mRNA陽(yáng)性表達(dá)率的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示：MMP－2mRNA與MMP－9mRNA陽(yáng)性表達(dá)率呈正相關(guān)關(guān)系 （r＝0.274，P＝0.006）。見(jiàn)表3。

3 討 論

MMPs是一類(lèi)能夠降解ECM和基底膜組分的蛋白水解酶，其家族成員目前已超過(guò)20個(gè)，根據(jù)各自降解底物的特異性和自身結(jié)構(gòu)的不同分為膠原酶、間質(zhì)溶解素和明膠酶。關(guān)于MMP－2在各種腫瘤組織及正常組織中的表達(dá)情況有多位學(xué)者進(jìn)行了研究，因所采用的研究方法不同，其研究結(jié)果不盡相同，甚至有些結(jié)果是截然相反的。李秀梅等［4］采用RT－PCR法檢測(cè)食管癌組織中MMP－2表達(dá)結(jié)果顯示：食管癌組織中MMP－2的表達(dá)較正常組織增高。多位學(xué)者［5－8］采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)食管癌組織中MMP－2的表達(dá)結(jié)果顯示：MMP－2在食管癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織。本研究結(jié)果顯示：食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的 MMP－2 mRNA的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，并且MMP－2mRNA的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，故認(rèn)為MMP－2在食管癌發(fā)生和浸潤(rùn)性生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。Hong等［9］和 Koskensalo等［10］應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中 MMP－2的表達(dá)，結(jié)果顯示：MMP－2與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)聯(lián)。Hwang等［11］應(yīng)用免疫組織化學(xué)法觀(guān)察胃癌組織中MMP－2的表達(dá)結(jié)果顯示：MMP－2與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。于維娜等［12］應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)食管癌組織中 MMP－2的表達(dá)結(jié)果顯示：MMP－2蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示：MMP－2的表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)聯(lián)，與上述研究結(jié)果一致，故認(rèn)為MMP－2在食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面不發(fā)揮關(guān)鍵作用。

表2 不同臨床特征食管鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織中MMP－2mRNA和MMP－9mRNA陽(yáng)性表達(dá)率Tab.2 Positive expression rates of MMP－2mRNA and MMP－9mRNA in tumor tissue of patients with different clinical characteristics

表3 癌組織中MMP－2mRNA和MMP－9mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性Tab.3 Correlation between expressions of MMP－2mRNA and MMP－9mRNA in tumor tissue

近年研究［13－14］顯示：MMPs在多種腫瘤組織中均高表達(dá)，且與腫瘤浸潤(rùn)有關(guān)聯(lián)。MMP－9在胃癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁正常胃黏膜組織，且MMP－9的表達(dá)與胃癌浸潤(rùn)深度有關(guān)聯(lián)；Chen等［15］對(duì)食管癌的研究發(fā)現(xiàn)：胎盤(pán)生長(zhǎng)因子（PLGF）促進(jìn)食管癌的轉(zhuǎn)移是通過(guò)對(duì)MMP－9的激活實(shí)現(xiàn)的。Li等［16］研究發(fā)現(xiàn)：環(huán)孢菌素A／MMP－9信號(hào)通路有助于食管癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變。有關(guān)食管癌的其他研究［17］也顯示：癌組織中MMP－9的表達(dá)水平高于癌旁正常組織，且其表達(dá)與食管癌浸潤(rùn)深度有關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示：癌組織中 MMP－9 mRNA陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，并且其表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果與上述各研究結(jié)論一致，故認(rèn)為MMP－9在食管癌發(fā)生及浸潤(rùn)性生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。Koskensalo等［10］應(yīng)用免疫組織化學(xué)法對(duì)結(jié)直腸癌的研究顯示：MMP－9的表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)聯(lián)。Durlik等［18］應(yīng)用免疫組織化學(xué)法對(duì)胰腺癌的研究發(fā)現(xiàn)：MMP－9的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)聯(lián)。Oshima等［19］應(yīng)用RT－PCR法對(duì)結(jié)直腸癌的研究發(fā)現(xiàn)：MMP－9與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)聯(lián)。Lu等［20］應(yīng)用免疫組織化學(xué)法對(duì)食管癌的研究發(fā)現(xiàn)：MMP－9與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示：MMP－9的表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)聯(lián)，與上述研究結(jié)果一致，故認(rèn)為MMP－9在食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面不發(fā)揮關(guān)鍵作用。

本研究結(jié)果顯示：MMP－2與 MMP－9mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明 MMP－2mRNA和MMP－9mRNA的表達(dá)之間有相互促進(jìn)的作用，可能相互協(xié)同促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。

綜上所述，食管癌的發(fā)生發(fā)展不是單一基因控制的反應(yīng)過(guò)程。本研究結(jié)果顯示：MMP－2和MMP－9可能促進(jìn)了食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生，同時(shí)可能增強(qiáng)了食管鱗狀細(xì)胞癌的浸潤(rùn)生長(zhǎng)能力；MMP－2和 MMP－9與食管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能均無(wú)關(guān)聯(lián)；MMP－2和 MMP－9表達(dá)水平的上調(diào)可能是食管癌發(fā)病的機(jī)制之一；對(duì) MMP－2和 MMP－9的聯(lián)合檢測(cè)可評(píng)價(jià)食管鱗狀細(xì)胞癌的浸潤(rùn)生長(zhǎng)程度。本研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明食管癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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