胡桃醌對宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響

張 巍，吳亞猛，陳思瑤，張琳娜，韓景春，那文婷，金 瑛

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013；3.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室，吉林 吉林 132013）

宮頸癌是一種常見的女性惡性腫瘤，近年來其發(fā)病呈年輕化的趨勢，引起廣大年輕女性的重視，因此對于抗宮頸癌藥物的研發(fā)極為迫切［1］。胡桃醌（Juglone）是從胡桃楸新鮮根、枝皮及青果皮等中提取出來的羥基奈醌類化合物，黃色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)為155℃，有升華性，微溶于熱水，是核桃楸中毒性物質(zhì)之一，具有抗腫瘤的活性［2－3］。胡桃醌在體外對肝癌和黑色素瘤等多種腫瘤細(xì)胞株具有細(xì)胞毒作用，可誘導(dǎo)其凋亡［4－6］。國內(nèi)外有很多關(guān)于胡桃醌抗腫瘤的報(bào)道，本課題組在前期研究［7－9］中發(fā)現(xiàn)：胡桃醌具有可抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞 （含HPV18DNA）的增殖及誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡的作用。本研究旨在研究胡桃醌對另外一種宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞 （含HPV16DNA）細(xì)胞周期的影響，從而為胡桃醌的抗宮頸癌作用提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 SiHa細(xì)胞由本學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。塞唑藍(lán) （MTT）、胡桃醌 （5－羥基－1，4－奈醌）和二甲基亞砜 （DMSO）購于美國Sigma公司。流式細(xì)胞儀購于美國Becton－Dickson公司，倒置顯微鏡購于德國Leica公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SiHa細(xì)胞用含10%新生小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，濕度95%。細(xì)胞單層貼壁生長，每2d更換1次培養(yǎng)基，細(xì)胞每周按1∶3傳代。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖活性和生長抑制率取對數(shù)生長期的SiHa細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞懸液密度為1×105mL－1，按每孔100μL接種于96孔培養(yǎng)板。分為對照組和不同濃度胡桃醌處理組 （用胡桃醌與完全培養(yǎng)液配制成 10、20、40、60、80 和100μmol·L－1不同的濃度培養(yǎng)），復(fù)孔數(shù)為3。待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，給藥后培養(yǎng)24h，每孔加入20μL MTT，37℃孵育4h，棄去上清后每孔加150μL DMSO，在搖床上低速振蕩10min，酶標(biāo)儀490nm波長測吸光度 （A）值并記錄結(jié)果，以A值代表細(xì)胞增殖活性，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率，半數(shù)抑制濃度 （IC50）通過SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件獲得。同時在倒置顯微鏡下觀察對照組及10和100μmol·L－1胡桃醌處理組細(xì)胞生長狀態(tài)并拍照。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的變化 給藥12h后，收集10和100μmol·L－1胡桃醌處理組細(xì)胞，同時以未處理細(xì)胞作為對照組，每組1×106個細(xì)胞，用70%冰乙醇4℃固定過夜，1000r·min－1離心5min，用PBS漂洗2次，之后每組加入PI染液400μL，4h避光孵育30min后過濾，最后上機(jī)，WinMDI軟件分析結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞生長抑制率以表示，F(xiàn)檢驗(yàn)方差齊性后，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組SiHa細(xì)胞增殖活性和生長抑制率 不同濃度胡桃醌處理SiHa細(xì)胞24h后，采用MTT法檢測得各組細(xì)胞A值，計(jì)算胡桃醌對宮頸癌SiHa細(xì)胞生長的抑制率，結(jié)果見表1。與對照組比較，不同濃度胡桃醌處理組細(xì)胞增殖活性降低，細(xì)胞生長抑制率升高，且呈濃度依賴性，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05或P＜0.01）。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線軟件可計(jì)算出胡桃醌對SiHa細(xì)胞的IC50為20.7μmol·L－1。

表1 各組SiHa細(xì)胞增殖活性和生長抑制率Tab.1 Proliferation activities and inhibitory rates of growth of SiHa cells in various groups （n＝3，）

表1 各組SiHa細(xì)胞增殖活性和生長抑制率Tab.1 Proliferation activities and inhibitory rates of growth of SiHa cells in various groups （n＝3，）

＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01compared with control group.

Group Cell proliferation activity（A value）Inhibitory rate of growth（η／%）Control 0.85±0.110 Juglone（μmol·L－1）10 0.72±0.12＊ 16.4±3.3＊20 0.43±0.06＊ 50.5±5.2＊40 0.32±0.08＊ 63.2±6.6＊60 0.28±0.03＊＊ 68.2±8.2＊＊80 0.20±0.04＊＊ 77.3±10.6＊＊100 0.15±0.06＊＊ 84.2±11.5＊＊

2.2 倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué) 對照組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，胡桃醌處理組細(xì)胞體積縮小，連接消失，與周圍細(xì)胞脫離，生長狀態(tài)差并呈劑量依賴性 （圖1）。

2.3 各組SiHa細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果 12h后與對照組比較，10和100μmol·L－1胡桃醌處理組SiHa細(xì)胞的亞二倍體峰 （SubG1）比率增加，而G0／G1和S期細(xì)胞比率均降低，G2／M期細(xì)胞比率先升高后降低。見圖2。

圖1 各組SiHa細(xì)胞形態(tài)學(xué)（×400）Fig.1 Morphology of SiHa cells in various groups（×400）

圖2 各組SiHa細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果Fig.2 Detection results of flow cytometry of SiHa cells in various groups

3 討 論

Pin1是癌細(xì)胞中普遍存在的高表達(dá)基因之一，與腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞分化和增殖有關(guān)，其在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，而在正常組織中低表達(dá)，去除Pin1則腫瘤細(xì)胞增殖減低，凋亡增加［10－11］。胡桃醌又名5－羥基－1，4－萘醌，是一種天然環(huán)狀醌類化合物，可從胡桃楸的葉及外殼中提取，是Pin1的天然抑制劑，其抗腫瘤作用在國內(nèi)外均有報(bào)道。胡桃醌的抗腫瘤活性主要是其能與Pin1催化域發(fā)生不可逆結(jié)合，從而抑制 Pin1 的活性［12－13］。

在本實(shí)驗(yàn)中，本文作者首先選用形態(tài)學(xué)及MTT法對胡桃醌的細(xì)胞毒性作用進(jìn)行初步的檢測，結(jié)果顯示：胡桃醌可抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖，形態(tài)學(xué)檢測可見對照組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，而胡桃醌處理組細(xì)胞生長受到抑制，生長狀態(tài)差，可見細(xì)胞皺縮，其變化的嚴(yán)重程度隨胡桃醌的劑量增加而增加，具有劑量依賴性。本研究中胡桃醌的IC50值為20.7μmol·L－1，說明胡桃醌對宮頸癌SiHa細(xì)胞具有毒性作用。

細(xì)胞周期是指連續(xù)分裂的細(xì)胞，從一次完成分裂開始，到下一次完成分裂時為止的過程。一般分為2個階段：分裂間期和分裂期［14－15］。目前檢測細(xì)胞周期的方法有流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦等。本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測胡桃醌對細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示：不同濃度胡桃醌可導(dǎo)致亞二倍體SubG1比率增加，而 G0／G1、S期細(xì)胞比率降低，但G2／M期的細(xì)胞比率先升高后降低。說明胡桃醌可導(dǎo)致SiHa細(xì)胞的周期發(fā)生改變，而僅有低劑量可誘發(fā)G2／M期阻滯。

綜上所述，胡桃醌具有抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞體外增殖的作用，并可誘導(dǎo)其細(xì)胞周期發(fā)生改變［16－18］，但其在誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞周期改變的過程中，細(xì)胞周期相關(guān)基因的變化及凋亡信號的產(chǎn)生還有待深入研究，以進(jìn)一步闡述胡桃醌抗腫瘤的作用機(jī)制。

［1］梁東霞.宮頸癌與HPV關(guān)系的研究進(jìn)展 ［J］.實(shí)用癌癥雜志，2010，25 （2）：202－205.

［2］楊 森，周麗霞，陸 莉，等.胡桃醌抗腫瘤機(jī)制的研究進(jìn)展 ［J］.吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，33 （1）：52－54.

［3］孔 賽，韓鳳娟，張志剛.中藥抗宮頸癌HPV感染的研究進(jìn)展 ［J］.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，9 （3）：319－322.

［4］陳 麗，張 建，汪思應(yīng)，等.胡桃醌對小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10體內(nèi)遷移的影響 ［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2012，17 （9）：978－982

［5］趙行宇，楊 森，周麗霞，等.胡桃醌對肝癌HepG－2細(xì)胞的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用 ［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2013，39 （2）：255－258

［6］Xu H，Yu X，Qu S，et al.Juglone，isolated from Juglans mandshurica Maxim，induces apoptosis via down－regulation of AR expression in human prostate cancer LNCaP cells ［J］.Bioorg Med Chem Lett，2013，23 （12）：3631－3634.

［7］Xin N，Hasan M，Li W，et al.Juglans mandshurica Maxim extracts exhibit antitumor activity on HeLa cells in vitro ［J］.Mol Med Rep，2014，9 （4）：1313－1318.

［8］張 巍，趙行宇，李 妍，等.不同濃度的胡桃醌對HeLa細(xì)胞的細(xì)胞凋亡作用的影響 ［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2012，38 （2）：13－16.

［9］Zhang W，Liu A，Li Y，et al.Anticancer activity and mechanism of Juglone on human cervical carcinoma HeLa cells［J］.Can J Physiol Pharmacol，2012，90 （11）：1553－1558.

［10］Driver JA，Zhou XZ，Lu KP.Pin1dysregulation helps to explain the inverse association between cancer and Alzheimer’s disease ［J］.Biochim Biophys Acta，2015，10.pii：S0304－4165 （15）00020－3.［Epub ahead of print］

［11］Wang JZ，Liu BG，Zhang Y.Pin1－based diagnostic andtherapeutic strategies for breast cancer ［J］.Pharmacol Res，2015，93：28－35.

［12］Chao SH，Greenleaf AL，Price DH.Juglone，an inhibitor of the peptidyl－prolyl isomerase Pin1，also directly blocks transcription ［J］.Nucleic Acids Res，2001，29 （3）：767－773.

［13］Xu HL，Yu XF，Qu SC，et al.Juglone，from Juglans mandshruica Maxim，inhibits growth and induces apoptosis in human leukemia cell HL－60through a reactive oxygen speciesdependent mechanism ［J］.Food Chem Toxicol，2012，50 （3／4）：590－596.

［14］俞 星，韓春姬，樸惠善，等.黨參皂苷D對HepG－2細(xì)胞增殖時間效應(yīng)和細(xì)胞周期的影響 ［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2012，38 （2）：236－239.

［15］Camargo MS，Oliveira MT，Santoni MM，et al.Effects of nemorosone，isolated from the plant Clusia rosea，on the cell cycle and gene expression in MCF－7BUS breast cancer cell lines ［J］.Phytomedicine，2015，22 （1）：153－157.

［16］張 瑩，李青艷，崔澤實(shí)，等.TSG101與HIF－1α在乳腺癌組織中的表達(dá)及意義 ［J］.中國實(shí)用內(nèi)科雜志，2014，34 （1）：96－98.

［17］周 錚.DEK與肺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究進(jìn)展 ［J］.中國實(shí)用內(nèi)科雜志，2013，33 （增1），159－163.

［18］朱玉嫻，梅長林.多囊腎病診治進(jìn)展 ［J］.中國實(shí)用內(nèi)科雜志，2014，34 （3）：223－226.