壽胎丸對(duì)去勢(shì)大鼠骨組織內(nèi)BMP和TGF-β表達(dá)的影響※

吳成林 陳京萍 程菊芬 梁 朗 朱淑惠

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)門診部，廣州510405）

壽胎丸對(duì)去勢(shì)大鼠骨組織內(nèi)BMP和TGF-β表達(dá)的影響※

吳成林 陳京萍 程菊芬 梁 朗 朱淑惠

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)門診部，廣州510405）

目的觀察壽胎丸對(duì)去勢(shì)大鼠骨組織內(nèi)骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone Morphogenetic Protein，BMP）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的影響。方法40只雌性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、壽胎丸組和戊酸雌二醇組，行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，壽胎丸組予壽胎丸13.4 g/kg/d灌胃，戊酸雌二醇組予補(bǔ)佳樂0.104 mg/kg/d灌胃，假手術(shù)組與模型組予等量生理鹽水灌胃。于術(shù)后12周處死動(dòng)物，切取大鼠股骨標(biāo)本分別檢測(cè)股骨近端骨組織形態(tài)學(xué)、骨組織中BMP和TGF-β含量及相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)。結(jié)果壽胎丸可明顯改善卵巢切除所引起的骨組織微觀結(jié)構(gòu)的破壞。模型組骨組織中BMP2、BMP4和TGF-β含量明顯低于假手術(shù)組（P＜0.05）；與模型組相比，壽胎丸組BMP2、BMP4和TGF-β，戊酸雌二醇組BMP2的含量均明顯增加（P＜0.05）。同時(shí)，模型組骨組織中，BMP2、BMP4和TGF-β的基因表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比壽胎丸組BMP2、BMP4和TGF-β，戊酸雌二醇組BMP2相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)均明顯增加（P＜0.05）。結(jié)論壽胎丸可明顯改善卵巢切除引起的骨組織微觀結(jié)構(gòu)的破化，這可能與壽胎丸提高骨組織內(nèi)BMP2、BMP4和TGF-β蛋白含量和相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)有關(guān)。

去勢(shì)大鼠；壽胎丸；骨形態(tài)發(fā)生蛋白；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；天癸

隨著社會(huì)老齡化的進(jìn)程，骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生率呈逐漸上升趨勢(shì)，全球范圍約有超過2億的女性患有骨質(zhì)疏松癥，其發(fā)生骨折的概率是男性的1.6倍，同時(shí)30%的絕經(jīng)后女性患有骨質(zhì)疏松，這些患者中的40%會(huì)發(fā)生一次或多次骨折，其所造成的醫(yī)療資源開支與癌癥相似，甚或超過之［1］。因此，有效預(yù)防和治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥已成為目前醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)之一。

BMP蛋白由成骨細(xì)胞合成和分泌，主要作用于骨基質(zhì)，可通過刺激和誘導(dǎo)成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Cbfa1的功能和表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化［2］。目前對(duì)骨形成產(chǎn)生影響的BMP蛋白主要為BMP2、BMP4、BMP6和 BMP7。TGF-β可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化［3］。中醫(yī)理論認(rèn)為腎虛是骨質(zhì)疏松的根本原因，故中醫(yī)藥治療以“腎主骨”為理，以“補(bǔ)腎”為法。壽胎丸在天癸理論指導(dǎo)下，將“腎-沖任-天癸”生殖軸與“腎主骨生髓”相結(jié)合，在臨床上用于治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松取得了良好的療效，但其具體機(jī)制尚不清楚。我們的前期研究［4］證實(shí)，常規(guī)劑量的壽胎丸可有效治療去勢(shì)大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，但具體的作用機(jī)制仍未闡明。因此，本實(shí)驗(yàn)通過建立絕經(jīng)后大鼠骨質(zhì)疏松模型，給予壽胎丸進(jìn)行干預(yù)，并觀察BMP和TGF-β的含量及相關(guān)調(diào)控的表達(dá)情況，探討壽胎丸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的具體作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組SPF級(jí)雌性SD大鼠（由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：4405900000816），10～12周齡，體重180～230 g，共40只，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為：A組，模型組；B組，假手術(shù)組；C組，壽胎丸組；D組，戊酸雌二醇組。

1.2 建立去勢(shì)大鼠模型A、C、D組大鼠，采用濃度為3%的苯巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，75%酒精消毒，取下腹部正中切口，進(jìn)入腹腔后探查并摘除雙側(cè)卵巢，結(jié)扎殘端；術(shù)后3天予青霉素5萬單位肌肉注射預(yù)防感染。術(shù)后第5天起，每天行陰道分泌物細(xì)胞學(xué)涂片檢查，連續(xù)9天，涂片無周期性變化，提示去勢(shì)徹底。B組大鼠，手術(shù)方法同上，僅切除雙側(cè)卵巢旁邊一小塊脂肪。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物壽胎丸水煎劑制備：每劑含生藥材共200 g，按菟絲子∶桑寄生∶續(xù)斷∶阿膠=2∶1∶1∶1的比例，菟絲子、桑寄生、續(xù)斷3味藥加水750 ml，水提1次，煎至150 ml，阿膠烊化，四味藥水煎液水浴濃縮至100 ml，濃度為2 g/ml（生藥材）。戊酸雌二醇片：補(bǔ)佳樂，1mg/片，由拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司提供，將之溶于蒸餾水中，定溶為0.02 mg/ml備用。

1.4 給藥方法于術(shù)后2周開始灌胃給藥，以后每隔24小時(shí)給藥1次，連續(xù)12周。A組和B組予生理鹽水，按5 ml/（kg·d）劑量灌胃，連續(xù)10周；C組予壽胎丸水煎劑，按13.4 g/（kg·d）劑量灌胃，連續(xù)10周；D組予戊酸雌二醇，按0.104 mg/（kg·d）劑量灌胃，連續(xù)10周。1.5指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 大鼠骨組織形態(tài)學(xué)取大鼠左側(cè)股骨全段，中間截?cái)嗪笾糜?0%中性福爾馬林溶液中固定48 h，于Plank脫鈣液中脫鈣24 h，流水沖洗24 h，Leica TP1020全自動(dòng)脫水機(jī)內(nèi)進(jìn)行脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋，切片，切片厚度5 μm，Leica全自動(dòng)染色機(jī)內(nèi)進(jìn)行HE染色。光學(xué)顯微鏡下放大100倍后觀察骨組織形態(tài)。

1.5.2 大鼠骨組織BMP、TGF-β相關(guān)蛋白含量切取大鼠股骨近端骨組織標(biāo)本，用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2～8℃的溫度1h后加入液氮，充分研磨成粉末狀，加入PBS（PH 7.4），離心20 min（3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，采用ELISA試劑盒按照說明書上的操作步驟分別測(cè)量骨組織中BMP2、BMP4、BMP6、BMP7和TGF-β的含量。

1.5.3 大鼠骨組織BMP、TGF-β相關(guān)基因的表達(dá)采用RT-PCP檢測(cè)BMP2、BMP4、BMP6、BMP7和TGF-β的表達(dá)。取大鼠新鮮股骨遠(yuǎn)端骨組織100 mg，液氮研磨后采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取總RNA，Thermo Multiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀配合Thermo μplate測(cè)定RNA濃度并分析純度。使用Takara PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用Takara SYBR?Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）在Biorad CFX96熒光定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s延伸，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)所用引物見表1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用（x±s）表示，組間差異采用方差分析，檢驗(yàn)水平為α=0.05，P＜0.05提示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨組織形態(tài)學(xué)如圖1所示，模型組中大鼠卵巢切除后，相比于假手術(shù)組，骨小梁變細(xì)，部分?jǐn)嗔?，連續(xù)性中斷，骨小梁排列紊亂，間隙增大，說明骨組織的微觀結(jié)構(gòu)遭到了破壞。在藥物干預(yù)組中，給予壽胎丸和戊酸雌二醇干預(yù)后，相較于假手術(shù)組，骨小梁增粗，無可見的斷裂，排列規(guī)則，間隙減小，說明兩種藥物的干預(yù)可改善骨組織內(nèi)微觀結(jié)構(gòu)的改變。

圖1 各組大鼠股骨近端骨組織形態(tài)學(xué)比較（HE，×100）

2.2 骨組織內(nèi)BMP和TGF-β的含量如表2所示，在模型組中，與假手術(shù)組相比較，骨組織內(nèi)BMP2、BMP4和TGF-β的含量明顯降低（P＜0.05），說明大鼠卵巢切除后，骨組織中成骨性蛋白的含量明顯下降。給予藥物干預(yù)后，在壽胎丸組中，與假手術(shù)組相比較，BMP2、BMP4和TGF-β的含量明顯增加（P＜0.05）；在戊酸雌二醇組中，BMP2的含量較假手術(shù)組明顯增加（P＜0.05）；同時(shí)，與戊酸雌二醇組相比，壽胎丸組中BMP4和TGF-β的含量明顯增加（P＜0.05）。

表2 各組骨組織BMP蛋白和TGF-β蛋白的含量（x±s）

2.3 骨組織內(nèi)BMP和TGF-β相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)如圖2所示，在模型組中，與假手術(shù)組相比較，BMP2、BMP4和TGF-βmRNA的表達(dá)均明顯降低（P＜0.05），說明，卵巢切除后骨形成的相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)明顯下降。藥物干預(yù)后，在壽胎丸組中，相比于模型組，BMP2、BMP4和TGF-βmRNA的表達(dá)明顯上調(diào)；在戊酸雌二醇組中，相比于模型組BMP2的mRNA表達(dá)明顯上調(diào)。與戊酸雌二醇組相比較，壽胎丸組中BMP4和TGF-β的表達(dá)明顯增加。

圖2 各組大鼠骨組織BMP和TGF-β相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)的比較

3 討論

在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中，骨組織的形成和修復(fù)過程由多種機(jī)制參與。其中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morpho-genetic proteins，BMPs）與誘導(dǎo)成骨關(guān)系最為密切，是正常胚胎時(shí)期骨形成和成年骨修復(fù)中最主要的生長(zhǎng)因子［5］。作為一種高效骨誘導(dǎo)物質(zhì)，BMPs是間充質(zhì)細(xì)胞向骨細(xì)胞系轉(zhuǎn)化的最初信號(hào)分子，它啟動(dòng)間充質(zhì)細(xì)胞向骨細(xì)胞分化。骨形成過程中BMP-Smad信號(hào)通路是最重要的細(xì)胞信號(hào)通路之一［6］，目前研究及應(yīng)用最多的是BMP2、4、6、7。參與BMP信號(hào)傳導(dǎo)的受體是一種跨膜糖蛋白，主要是I型受體和Ⅱ型受體。BMP通過與Ⅱ型受體結(jié)合形成復(fù)合物，Ⅱ型受體發(fā)生自身磷酸化而活化，并迅速與I型受體結(jié)合形成三元復(fù)合物。此時(shí)，在活化的Ⅱ型受體激酶作用下，I型受體磷酸化而被激活，隨后I型受體激酶會(huì)激活信號(hào)傳導(dǎo)分子R-Smads（包括Smad-1、Smad-3、Smad-5、Smad-8），使R-Smads磷酸化。具有活性的磷酸化RSmads與一種普通調(diào)節(jié)信號(hào)分子Smads-4結(jié)合后，信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，共同作用于靶基因而轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)相應(yīng)蛋白［7］。

TGF-β在骨組織重建過程中，具有重要作用。在成骨細(xì)胞中，TGF-β可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，并促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原［8］。同時(shí)TGF-β可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化［9］。TGF-β還可作用于破骨細(xì)胞，介導(dǎo)破骨細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的骨吸收作用［10］。實(shí)驗(yàn)研究顯示［11-12］，大鼠卵巢切除后，骨組織中TGF-β含量明顯降低，給予TGF-β局部注射后可明顯增加骨形成作用。

采用大鼠雙側(cè)卵巢切除術(shù)，構(gòu)建了大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型。研究結(jié)果顯示，去勢(shì)后大鼠骨組織微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯破壞，同時(shí)骨組織內(nèi)BMP2、BMP4和TGF-β含量明顯下降，并伴隨著BMP2、BMP4和TGF-β基因表達(dá)的下調(diào)。這說明BMP2、BMP4和TGF-β很可能參與了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病過程。在我們給予壽胎丸干預(yù)后，骨組織微觀結(jié)構(gòu)得到明顯改善，同時(shí)BMP2、BMP4和TGF-β在蛋白及基因水平的表達(dá)明顯上調(diào)。因此，我們推論，壽胎丸可通過上調(diào)骨組織中BMP2、BMP4和TGF-β的表達(dá)水平治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。

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Effects of Shoutai Pill on Expression of BMP and TGF-β in Bone Tissue of Ovariectomized Rat

WU Chenglin，CHENJingping，CHENGJufen，LIANGLang，ZHU Shuhui
（Out-patient department，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou510405，China）

Objective To observe effects of Shoutai pill on expression of BMP and TGF-β in ovariectomized rat.Methods Totally 40 female healthy SD rats were divided into sham group，ovariectomized group，Shoutai pill group and Progynova group.The bilateral oophorectomy was conducted.The rats in Showtai pill group were intervened by Shoutai pill with the dosages 13.4 g/kg/d and the rats in Progynova group were intervened by Progynova with the dosage of 0.104 mg/kg/d.In Sham group and ovariectomized group，equal quantity saline were intragastric administration.The rats were executed at 12 weeks after the operation，the histomorphology changes of bone were observed with HE stain，the content of BMP2，BMP4，BMP6，BMP7，TGF-β and the related regulating gene were detected.Results The application of Showtai pill could significantly ameliorate the microstructure changes of bone tissue.In bone tissues of ovariectomized group，the content of BMP2，BMP4 and TGF-β were significantly decreased than that those of the sham group（P＜0.05）.Comparing with ovariectomized group，the content of BMP2，BMP4 and TGF-β，and BMP2 in Progynova group were significantly increased（P＜0.05）. Meanwhile，comparing with the sham group，the mRNA expression of BMP2，BMP4 and TGF-β in the ovariectomized group were significantly decreased（P＜0.05）.Comparing with the ovariectomized group，the mRNA expression of BMP2，BMP4 and TGF-βin of the Shoutai pill group and BMP2 in the Progynova group were significantly increased（P＜0.05）.Conclusion The application of Showtai pill could significantly ameliorate the microstructure changes of bone tissue.This effect was likely be caused by increasing the content of BMP2，BMP4，TGF-β and the related mRNA expression.

ovariectomized rat；Showtai pill；bone morphogenetic protein；transforming growth factor-β；animal experiment；tian gui

10.3969/j.issn.1672-2779.2015.14.069

1672-2779（2015）-14-0133-03

：楊杰本文校對(duì)：黃進(jìn)

2015-06-11）

廣東省中醫(yī)藥局科研課題（No：20132119）；教育部高等學(xué)校博士點(diǎn)基金（No：20114425120016）