冬蟲夏草浸出液合用硫唑嘌呤對(duì)大鼠肝移植后免疫調(diào)節(jié)的影響

鄒佩霞，李 敏，李 莉，王文杰，陳德森*

（1．十堰市太和醫(yī)院兒科，湖北十堰442000；2．湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北十堰442000）

冬蟲夏草浸出液合用硫唑嘌呤對(duì)大鼠肝移植后免疫調(diào)節(jié)的影響

鄒佩霞1，李 敏1，李 莉2，王文杰1，陳德森2*

（1．十堰市太和醫(yī)院兒科，湖北十堰442000；2．湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北十堰442000）

目的 觀察冬蟲夏草浸出液合用硫唑嘌呤對(duì)大鼠減體積1／2肝臟移植后免疫調(diào)節(jié)功能的影響。方法 80只大鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、硫唑嘌呤組、冬蟲夏草組，采用改良雙袖套法進(jìn)行1／2大鼠同種異體減體積原位肝臟移植，術(shù)后硫唑嘌呤組用硫唑嘌呤稀釋溶液灌胃1.0 mg／（kg?d）、冬蟲夏草組用6%冬蟲夏草浸出液（10 mL／kg）加硫唑嘌呤1.0 mg／（kg?d）灌胃。于治療21 d后，測(cè)定肝微粒體細(xì)胞色素P450亞型酶（CYPIA2、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4）活性，血清總蛋白、白蛋白、血紅蛋白，靜脈血紅細(xì)胞、白細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)量，受體大鼠感染率。結(jié)果 冬蟲夏草浸出液明顯抑制存活受體大鼠P450亞型酶CYPIA2（0.68±0.09）、CYP3A4酶的活性（4.92±0.27），降低靜脈血紅細(xì)胞（6.71±0.87）、白細(xì)胞數(shù)量（10.36±0.09），提高血清總蛋白（19.39±4.93）、白蛋白（14.27±4.45）及血紅蛋白含量（19.39±4.973），明顯降低受體大鼠感染率40.87%。與硫唑嘌呤組比較，P＜0.05。對(duì)T淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯影響，與硫唑嘌呤組比較，P＞0.05。結(jié)論 冬蟲夏草浸出液在不影響硫唑嘌呤抑制肝移植排斥反應(yīng)的同時(shí)，改善肝臟移植后低蛋白血癥，提高體液免疫，對(duì)細(xì)胞免疫功能無(wú)明顯影響，具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用。

大鼠；冬蟲夏草浸出液；硫唑嘌呤；肝臟移植；免疫調(diào)節(jié)

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康SD大鼠80只，SPF級(jí)，9～l2周齡，體質(zhì)量250～300 g，雌雄兼用，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用許可證SYXK（鄂）2014-0031，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK（鄂）2014-0008。采用隨機(jī)數(shù)字表編號(hào)，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、硫唑嘌呤組、冬蟲夏草組，每組20只，即供、受體和10只（對(duì)本組供、受體配對(duì)交叉原位1／2減體積肝移植）。

1.2 藥品試劑及儀器 硫唑嘌呤片（常州亞邦制藥有限公司，5mg／片，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20053413）；冬蟲夏草（購(gòu)自十堰市太和醫(yī)院中藥房）；戊巴比妥鈉（北京化學(xué)試劑公司，德國(guó)進(jìn)口分裝 ，批號(hào)：061222）；Waters2010型高效液相色譜儀（迪馬公司）；雙目連續(xù)變倍體視顯微鏡（上海嚴(yán)豐精密儀器有限公司，型號(hào)：YF501）；貝克曼庫(kù)爾特AU5800全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司，型號(hào)：AU5800）；SHA-C水浴恒溫振蕩器（金壇市億通電子有限公司）；CAY-1型液體快速混合器（北京長(zhǎng)安儀器廠）；顯微外科無(wú)損傷縫合線（寧波醫(yī)用縫針有限公司，規(guī)格：10／0）；GR22GⅡ型高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beck-man公司）；KQ-500E型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 大鼠肝臟移植手術(shù)方法 參照文獻(xiàn)［3］，每對(duì)供、受體大鼠體質(zhì)量相差≤15 g，供體及受體術(shù)前均禁食12 h，不禁水。術(shù)前10 min肌肉注射阿托品0.04 mg，分別對(duì)模型組、硫唑嘌呤組、冬蟲夏草組用2%戊巴比妥鈉（按45 mg／kg）麻醉。仰臥位固定，對(duì)同組供體及受體大鼠同時(shí)進(jìn)行改良雙袖套法（“4貫通、3結(jié)扎、2回折法”）手術(shù)，為保證大鼠動(dòng)、靜脈吻合精確，提高手術(shù)成功率，所有手術(shù)均在雙目連續(xù)變倍體視顯微鏡下進(jìn)行。受體自身肝臟切除與供體1／2減體積相同，原位置入受體腹腔進(jìn)行配對(duì)交叉肝臟移植。術(shù)后分層關(guān)閉腹腔，碘伏消毒創(chuàng)口1周（1次／d），頭孢克洛0.1 g，100 g／d肌肉注射預(yù)防感染（5 d），術(shù)后動(dòng)物飼養(yǎng)應(yīng)滿足動(dòng)物福利要求，動(dòng)物房溫度18～25℃，濕度50%～75%，大鼠單籠飼養(yǎng)，12 h交替光照使盡快復(fù)溫，動(dòng)物蘇醒后自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)，每日觀察動(dòng)物進(jìn)食情況，稱體質(zhì)量，及時(shí)清理糞便，消毒護(hù)理時(shí)盡量減少動(dòng)物的疼痛和不適等［4］。

1.4 冬蟲夏草浸出液提取及治療方法 參照文獻(xiàn)［5］，乙醇提取法：在攪拌槽內(nèi)，將50 g按1∶2～8重量比加入50%～95%乙醇，提取時(shí)間為1～24 h，提取溫度為20～60℃；離心：將醇液與基質(zhì)沉淀物進(jìn)行固液分離，得到醇提液和沉淀物；醇提取液濃縮干燥：用減壓蒸餾方法將醇提液濃縮至漿狀，然后烘干，即得含蟲草素和蟲草酸的醇提物。使用時(shí)用注射用生理鹽水稀釋到6%，硫唑嘌呤用碾缽碾碎后用生理鹽水稀釋到1%。大鼠肝臟移植手術(shù)成功后，硫唑嘌呤組用1%硫唑嘌呤1.0 mL／（kg?d）灌胃；冬蟲夏草組用6%冬蟲夏草浸出液（10 mL／kg）加1%硫唑嘌呤1.0 mg／（kg?d）灌胃；對(duì)照組及模型組灌生理鹽水（按10 mL／kg）。連續(xù)治療21 d。

1.5 檢測(cè)指標(biāo) 參照文獻(xiàn)［6］，在治療21 d后，選擇存活各組大鼠各10只，均經(jīng)眶靜脈采取血0.5 mL，測(cè)定血清總蛋白、白蛋白、血紅蛋白，靜脈血紅細(xì)胞、白細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞數(shù)量。動(dòng)物斷頭處死取肝臟，4℃下9 000 r／min，離心20 min，取上清液肝微粒體體外孵育，37℃預(yù)孵育30 min，后取上清液用高效液相色譜儀進(jìn)樣檢測(cè)CYPIA2、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較均采用 t檢驗(yàn)，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冬蟲夏草浸出液對(duì)肝微粒體細(xì)胞色素P450亞型酶的影響 見表1。

表1 冬蟲夏草浸出液對(duì)肝微粒體細(xì)胞色素P450亞型酶的影響（±s，n＝10） nmol／mL

表1 冬蟲夏草浸出液對(duì)肝微粒體細(xì)胞色素P450亞型酶的影響（±s，n＝10） nmol／mL

注：與模型組比較 ，＃P＜0．05；與空白對(duì)照組比較 ，△P＜0．05；與治療前比較，▲P＜0．05；與硫唑嘌呤組比較 ，☆P＜0．05

組 別 感染率／% CYPIA2 CYP2C9 CYP2D6 CYP2E1 CYP3A4對(duì)照組 治療前 0 1．57±0．15 2．34±0．13 4．58±0．15 1．57±0．13 6．59±0．25治療后 0 1．42±0．11 2．40±0．08 4．57±0．10 1．53±0．15 6．49±0．30模型組 治療前 1．53±0．17 2．38±0．15 4．57±0．12 1．54±0．14 6．55±0．21治療后 8（80．23） 2．45±0．19△▲ 2．43±0．21 4．61±0．20 1．55±0．21 10．50±0．39△▲硫唑嘌呤組 治療前 1．50±0．14 2．36±0．13 4．56±0．21 1．50±0．15 6．56±0．25治療后 6（60．35）＃ 0．67±0．09▲＃ 2．29±0．20 4．54±0．17 1．49±0．17 5．02±0．33▲＃冬蟲夏草組 治療前 1．59±0．12 2．54±0．13 4．53±0．14 1．51±0．12 6．07±0．31治療后 4（40．87）＃☆ 0．68±0．09▲☆ 2．65±0．07 4．55±0．24 1．47±0．16 4．92±0．27▲☆

2.2 冬蟲夏草浸出液對(duì)肝移植大鼠免疫系統(tǒng)的影響見表2。

表2 冬蟲夏草浸出液對(duì)肝移植大鼠免疫系統(tǒng)的影響（±s，n＝10）

表2 冬蟲夏草浸出液對(duì)肝移植大鼠免疫系統(tǒng)的影響（±s，n＝10）

注：與模型組比較 ，＃P＜0．05；與空白對(duì)照組比較 ，△P＜0．05；與治療前比較，▲P＜0．05；與硫唑嘌呤組比較 ，☆P＜0．05

治療后紅細(xì)胞／（個(gè)／μL） 8．56±0．65 8．61±0．73 8．28±0．74 7．83±0．85△▲ 8．97±0．83 6．59±0．54▲＃ 8．39±0．23 6．71±0．870▲☆白細(xì)胞／（個(gè)／μL） 12．25±2．10 12．22±2．16 12．27±2．16 10．20±2．19△▲ 12．32±3．19 9．94±2．12▲＃ 12．15±0．24 10．36±0．090▲☆單核細(xì)胞／% 2．39±0．29 2．50±0．32 2．32±0．27 4．30±0．22△▲ 2．59±0．33 1．75±0．34▲＃ 2．39±0．29 1．86±0．370 T淋巴細(xì)胞／% 73．33±5．21 73．56±5．37 71．10±5．29 87．37±6．49△▲ 69．59±5．97 43．76±5．07▲＃ 47．27±4．26 47．79±5．350總蛋白／（g／100mL）15．60±2．36 17．52±2．31 14．91±2．17 11．21±3．20△▲ 15．54±1．98 8．74±1．18▲＃ 16．22±3．03 19．39±4．930▲☆白蛋白／（g／100mL）11．39±2．81 13．24±2．15 12．61±2．73 9．27±2．24△▲ 12．73±2．20 5．27±1．79▲＃ 11．50±2．50 14．27±4．450▲☆血紅蛋白／（g／100mL）14．60±7．36 15．52±6．31 14．91±2．17 11．21±3．20△▲ 15．54±1．98 7．74±1．18▲＃ 15．22±3．03 19．39±4．973項(xiàng)目 對(duì)照組治療前 治療后模型組治療前 治療后硫唑嘌呤組治療前 治療后冬蟲夏草組治療前▲☆

3 討論

冬蟲夏草（cordyceps sinensis，CS）是麥角菌科真菌寄生在蝙蝠娥科昆蟲幼蟲的子座及幼蟲尸體上長(zhǎng)成的蟲草體與菌座復(fù)合體［7］，含有豐富的蟲草多糖、氨基酸、核苷、多種微量元素及甾醇類，味甘、性溫、歸腎、肺經(jīng)，養(yǎng)肺陰、補(bǔ)腎陽(yáng)、止咳化痰、抗癌防老?，F(xiàn)代藥理研究［8］證實(shí)，其具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、降壓、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)腎臟和肝臟等作用?！侗静輳男隆费云溆小氨７?、止血、化痰、益腎”之功效，是我國(guó)傳統(tǒng)的滋補(bǔ)中藥［9］。近年來(lái)在創(chuàng)傷、大手術(shù)、器官移植時(shí)作為免疫調(diào)節(jié)劑而被廣泛應(yīng)用［10］。其藥理作用主要是提高機(jī)體免疫力、調(diào)控腎臟固有細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)合成，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子及改善機(jī)體代謝機(jī)制，減少尿蛋白、改善腎功能及減輕腎臟病理改變等作用［11-12］。

在肝移植術(shù)后，由于手術(shù)創(chuàng)傷及異體排斥反應(yīng)，需要大量應(yīng)用免疫抑制藥及抗感染治療，而這類藥物均由細(xì)胞色素P450亞型酶代謝［13］。在本實(shí)驗(yàn)研究中 ，筆者采用P450亞型酶活性及總蛋白、白蛋白、血紅蛋白、靜脈血紅細(xì)胞、白細(xì)胞、T-淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞數(shù)量，受體大鼠感染率等指標(biāo)評(píng)定冬蟲夏草浸出液對(duì)大鼠肝移植術(shù)后免疫調(diào)節(jié)功能的影響。結(jié)果顯示，冬蟲夏草組大鼠在治療21 d后，CYPIA2及CYP3A4活性降低，這利于器官移植后抗排斥藥硫唑嘌呤的代謝，減輕其不良反應(yīng)，增加療效。CYPIA2、CYP3A4酶主要在肝臟組織中表達(dá)，占肝臟P450蛋白含量的13%以上，與許多的藥物代謝及藥物的相互作用密切相關(guān)［12］。CYPIA2、CYP3A4酶的活性升高代表所使用的藥物臨床不良反應(yīng)增加，療效降低，故在臨床使用時(shí)應(yīng)盡量避免與經(jīng)P450亞型酶代謝的藥物聯(lián)合應(yīng)用，以免影響療效。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)冬蟲夏草組具有降低P450亞型酶，減少不良反應(yīng)的作用。靜脈血紅、白細(xì)胞，T-淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞數(shù)量明顯降低，說(shuō)明其不影響免疫抑制劑硫唑嘌呤抑制T-淋巴細(xì)胞的生成，降低T-淋巴細(xì)胞的吞噬作用［14-16］。本研究認(rèn)為 ，冬蟲夏草作為免疫調(diào)節(jié)劑，在不影響硫唑嘌呤抑制細(xì)胞免疫的同時(shí)，提高了機(jī)體的體液免疫功能，可使總蛋白、白蛋白及血紅蛋白、血清IgG升高，對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)具有雙向調(diào)節(jié)作用，即在對(duì)實(shí)質(zhì)器官進(jìn)行選擇性免疫抑制的同時(shí)，不降低機(jī)體體液免疫系統(tǒng)的免疫防御作用，明顯降低了術(shù)后感染的發(fā)生率，是一種較理想的免疫調(diào)節(jié)劑。

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Cordyceps sinensis from leaching solution of azathioprine on regulating immune response after liver transplantation in rats

ZOU Peixia1，LI Min1，LI Li2，WANG Wenjie1，CHEN Desen2*

（1．Pediatric Department，Shiyan Taihe Hospital，Shiyan 442000，Hubei Province，China；2．Hubei Medical College，Shiyan 442000，Hubei Province，China）

Objective To observe the effects of cordyceps sinensis extract combined with azathioprine on rat reduced size liver 1／2 immune function after transplantation．Methods 80 rats are randomly divided into blank control group，model group，azathioprine，cordyceps sinensis group，1／2 of rat orthotopic liver transplantation with reduced size modified cuff technique，postoperative azathioprine azathioprine dilute solution by gavage 1．0 mg／（kg?d），Cordyceps sinensis extract group 6% （10 mL／kg）＋oral azathioprine 1．0 mg／（kg?d）by gavage．In 21 days of treatment（d），the determination of hepatic microsomal cytochrome P450isoforms（CYPIA2，CYP2C9，CYP2D6，CYP2E1，CYP3A4）activity，serum total protein，albumin，hemoglobin，red blood cells，white blood cells，T lymphocytes，the number of mononuclear cells，receptor of rat infection rate．Results Cordyceps sinensis extract significantly inhibites the survival rate of the recipient rat P450isoforms of CYPIA2（0．68±0．09），the enzyme activity of CYP3A4（4．92±0．27），lower vein red blood cells（6．71±0．87），the number of white blood cells（10．36±0．09），increased serum total protein，albumin（19．39±4．93）（14．27±4．45）and hemoglobincontent（19．39±4．973）is significantly lower in rats，the infection rate of 40．87% ．Compared with azathioprine（P＜0．05），the differences are statistically significant．There is no significant effect on the number of T lymphocytes and mononuclear cells，compared with azathioprine group，P＞0．05．Conclusion Cordyceps sinensis extract on azathioprine suppresses hepatic allograft rejection and at the same time，improve hypoproteinemia after liver transplantation，enhance humoral immunity，and has no significant effect on the cellular immune function，it has a dual immunomodulatory activity．

rats；cordyceps sinensis extract；azathioprine；liver transplantation；immune regulation大鼠同種異體1／2減體積原位肝臟移植為成熟的肝移植方法之一［1］，由Lee于1973年報(bào)道［2］，該動(dòng)物模型可真實(shí)的反應(yīng)肝移植術(shù)后機(jī)能排斥反應(yīng)，為臨床治療提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者采用改良雙袖套法進(jìn)行大鼠同種異體1／2減體積原位肝臟移植，系統(tǒng)觀察了冬蟲夏草浸出液合用硫唑嘌呤對(duì)肝移植術(shù)后大鼠免疫調(diào)節(jié)功能的影響，為其臨床肝臟移植的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。

R285.5

A

2095-6258（2015）05-0901-04

10．13463／j．cnki．cczyy．2015．05．007

2015-02-10）

鄒佩霞（1962-），女，主管護(hù)師，主要從事臨床藥理學(xué)與護(hù)理學(xué)研究。

*通信作者：陳德森，電話-18972486567，電子信箱-cdscds1226＠126.com