羊口瘡病毒湖北株F1L基因克隆與遺傳進(jìn)化分析

郭 銳，田永祥，周丹娜，段正贏，楊克禮，劉澤文，袁芳艷，劉 威，刑崔昱，裴小英

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430064；2.動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)；4.武漢市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所）

疾病防控

羊口瘡病毒湖北株F1L基因克隆與遺傳進(jìn)化分析

郭 銳1，2，田永祥1，2，周丹娜1，2，段正贏1，2，楊克禮1，2，劉澤文1，2，袁芳艷1，2，劉 威1，2，刑崔昱3，裴小英4

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430064；2.動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)；4.武漢市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所）

為了分析羊口瘡病毒湖北株（ORFV-HB-YX株）F1L基因遺傳變化規(guī)律，參照GenBank公布的ORFV-F1L基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)ORFV-HB株F1L基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆、測(cè)序以及遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示：F1L基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為999 bp，編碼333個(gè)氨基酸，系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示HB-YX株與GenBank參考毒株的核苷酸序列同源性為95.0%～98.0%，與福建FJ-GO株同源性高達(dá)98%，親緣關(guān)系最近，屬于同一分支。

羊口瘡病毒；F1L基因；克??；遺傳進(jìn)化分析

羊口瘡（ORF）又稱羊傳染性膿皰口炎或羊傳染性膿皰等，是由羊口瘡病毒（orfvirus，ORFV）引起的一種綿羊和山羊的高度接觸性人畜共患傳染病，也會(huì)感染其他野生反芻動(dòng)物如鹿、麝牛等，以羔羊最為易感［1］。近年來，羊口瘡在湖北省內(nèi)臨床病例呈逐漸上升趨勢(shì)，以口唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水泡、膿皰和結(jié)成疣狀結(jié)痂為特征［2］，同時(shí)容易繼發(fā)細(xì)菌感染，如葡萄球菌、鏈球菌和變形桿菌等，以羔羊發(fā)病為主，嚴(yán)重者死亡率可達(dá)30%。

ORFV的基因組結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，為線性dsDNA，其長度134～139 kb。目前公認(rèn)的ORFV基因組共包含130多個(gè)基因，由兩個(gè)相同的反向末端重復(fù)區(qū)（ORFs 001～008和ORF 112～134）和中央編碼區(qū)（ORFs 009～111）組成。F1L基因是ORFV基因組的第59個(gè)開放閱讀框，編碼39 ku蛋白，位于基因組中部高度保守區(qū)域［3-5］。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)該基因研究也較多，如蘇高莉等［6］、吉艷紅等［7］、劉媛等［8］已證實(shí)F1L蛋白為免疫優(yōu)勢(shì)蛋白，能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，有利于清除病原體，有助于闡明ORFV致病機(jī)制與新型疫苗研究，也為ORF的綜合防控提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

羊口瘡病毒湖北株（HB-YX株）由本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD18-T載體、DNA限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ、rTaq DNA、E.coli DH5α聚合酶購自大連寶生物工程有限公司；DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 病毒DNA的提取

按照DNA提取試劑盒說明操作提取HB-YX株DNA并-20℃保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中公布的F1L基因序列（登錄號(hào)：AY386264）并參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，上游引物P1：5'-CCCAAGCTTATGGATCCACCCGAAATCACGGCC -3'；下游引物P2：5'-CGGAATTCTCACACAATGGCCGTGACCAGCAGCC-3'，下劃線處分別為HindⅢ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 000 bp，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 HB-YX株F1L基因的擴(kuò)增

用1.2中提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系體積為50 μL，其中10 μmol/L濃度的上下引物各1 μL，模板5 μL，2×EasyTaq PCR Mix 25 μL，添加ddH2O至50 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，68℃退火45 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定反應(yīng)體系為10 μL，依次加入PCR產(chǎn)物5 μL、pMD18-T載體1 μL、連接緩沖液4 μL，16℃連接4 h。取5 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化用DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂于含氨芐青霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜。從平板上挑取單菌落接種于3 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。用菌液提取質(zhì)粒，用HindⅢ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶酶切鑒定。將酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送到上海生工生物工程有限公司測(cè)序，利用基因分析軟件MegAlign 5.0對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，參考毒株信息見表1。

表1 參考毒株信息

2 結(jié)果與分析

2.1 HB-YX株F1L基因的擴(kuò)增

進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到999 bp的片段，與預(yù)期相符，見圖1。

圖1 HB-YX株F1L基因PCR擴(kuò)增電泳圖

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

提取重組質(zhì)粒pMD18-T-F1L后，選用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切后，獲得兩條大小為2 692 bp和999 bp左右的基因片段，分別與預(yù)期基因片段大小相符，見圖2。

圖2 重組質(zhì)粒PCR鑒定

2.3 F1L基因序列測(cè)定

將鑒定的陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，對(duì)測(cè)序結(jié)果應(yīng)用MegAlign 5.0軟件進(jìn)行拼接，HB-YX分離株F1L基因序列長999 bp，編碼333個(gè)氨基酸，見圖3。

圖3 ORFV-HB株F1L基因測(cè)序結(jié)果

2.4 HB-YX-F1L基因片段的氨基酸同源性分析

用MegAlign 5.0軟件進(jìn)行氨基酸同源性分析表明，HB-YX株和GenBank中公布的21個(gè)不同ORF毒株的F1L基因氨基酸序列同源性為95.0%～98.0%，與福建FJ-GO株同源性高達(dá)98%，親緣關(guān)系最近，為同一分支，見圖4。

圖4 HB-YX株F1L基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

近年來湖北省大力發(fā)展山羊養(yǎng)殖業(yè)，種羊需求量巨大，因此從全國各地大量引種。由于引種過程耗時(shí)長，以及新環(huán)境引起的應(yīng)激，導(dǎo)致山羊機(jī)體免疫力下降，如果此時(shí)山羊體內(nèi)已經(jīng)受羊口瘡病毒隱性感染，極易出現(xiàn)排毒現(xiàn)象，導(dǎo)致羊口瘡的暴發(fā)。目前市場(chǎng)上沒有治療羊口瘡的特效藥，所以對(duì)于羊口瘡的預(yù)防工作就顯得尤為重要。國內(nèi)外羊口瘡疫苗的研發(fā)經(jīng)歷了痂皮強(qiáng)毒疫苗、滅活疫苗、弱毒疫苗幾個(gè)階段，雖然有研究報(bào)道制備成功了亞單位疫苗和DNA疫苗，但仍然處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，并沒有上市銷售。同時(shí)不少文獻(xiàn)報(bào)道國內(nèi)羊口瘡弱毒疫苗株免疫后不能提供有效的保護(hù)，而且不同地區(qū)、不同毒株的血清型存在差異，因此一種羊口瘡疫苗并不能預(yù)防所有地域羊口瘡的發(fā)生，導(dǎo)致羊群出現(xiàn)免疫失敗和重復(fù)感染現(xiàn)象[9]，還極易繼發(fā)細(xì)菌感染（鏈球菌、葡萄球菌、變形桿菌等），造成極高的死亡率。

本實(shí)驗(yàn)成功克隆出HB-YX株F1L基因，序列全長999 bp，通過與國內(nèi)外已公布序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，HB-YX株與GenBank參考毒株的核苷酸序列同源性為95.0%～98.0%，雖屬于高度保守區(qū)域，仍存在一定的差異。HB-YX株與福建FJ-GO株同源性最高達(dá)98.0%，同屬于一個(gè)分支，通過核苷酸序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)存在一定的基因突變現(xiàn)象，主要突變點(diǎn)在160位處，比FJ-GO株缺少了GCGCCGGCCCCT共12個(gè)堿基。環(huán)境改變和免疫壓力等因素可能是造成F1L基因變異的原因，這種變異性對(duì)其生物學(xué)特性的影響還有待考證。本研究闡明了湖北省羊口瘡流行毒株的F1L基因變異情況，也為今后對(duì)F1L基因的蛋白表達(dá)、相關(guān)基因功能研究和新的ORF疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

［1］ 殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2008：423-445.

［2］ Abrahao J S，Campos R K，Trindade G S，et al.Detection and phylogenetic analysis of Orf virus from sheep in Brazil：a case report［J］.Virol J，2009（6）：47.

［3］ 王鍇樺.羊傳染性膿皰病毒F1L基因重組腺病毒的構(gòu)建與鑒定［D］.長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

［4］ 趙魁.羊傳染性膿皰病毒重組DNA疫苗的構(gòu)建與實(shí)驗(yàn)免疫研究［D］.長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［5］ 李前瑞，李杰，田婷婷，等.羊口瘡病毒多重PCR檢測(cè)方法的建立［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013（6）：36-38.

［6］ 蘇高莉，趙魁，孫秀萍，等.羊口瘡病毒農(nóng)安分離株的分離鑒定及Orf059（F1L）基因的序列分析［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，33（1）：4-8.

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［8］ 劉嬡，楊鈺，鮮思美，等.羊口瘡病毒貴州株F1L基因克隆及生物信息學(xué)分析［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2015，42（1）：53-60.

［9］ Friebe A，F(xiàn)riederich S，Scholz K，et al.Characterization of immunotimsulatorycomponents of orf virus（Parapoxvirus ovis）［J］.J Gen Virol，2011，92（7）：1571-1584.

Cloning and Phylogenetic Analysis of F1L Gene of Orf Virus Isolated in Hubei

GuoRui1，2，Tian Yongxiang1，2，Zhou Danna1，2，et al
（1.Institute ofAnimal Husbandryand Veterinary，Hubei AcademyofAgricultural Science，Wuhan 430064，China；2.Hubei KeyLaboratoryofAnimal EmbryoEngineeringand Molecular Breeding，Wuhan 430064，China）

In order toanalyze the orfvirus Hubei strain（ORFV-HB-YX strain）genetic variation ofF1L gene，specific primers for ORFV-F1L gene sequence published by GenBank was designed，the PCR gene of ORFV-HB strain was amplified,cloned and sequenced,and the genetic analysis ofF1L gene was carried out.The result displayed that gene F1L amplification product size was 999 bp,encoding 333 amino acids.Phylogenetic tree showed that the homology of nucleotide sequence of HB-YX strain with GenBank strain was 95.0%～98.0%,the homology with the Fujian FJ-GO strain was 98%，it indicated that they belonged to the same branch.

Orfvirus;F1L gene;clone;phylogenetic analysis

S826.2，827.2

A

2095-3887（2015）06-0031-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.06.010

2015-08-17

湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心資助項(xiàng)目（2015-620-004-001）；動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題項(xiàng)目（2015ZD150）；國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303035）

郭銳（1981-），男，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物疫病防控研究。

田永祥，研究員。