乙型肝炎病毒核酸實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)在臨床診斷中的價(jià)值

魏留柱 （內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市臨河市人民醫(yī)院免疫科，內(nèi)蒙古 臨河051000）

乙型肝炎病毒核酸實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)在臨床診斷中的價(jià)值

魏留柱 （內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市臨河市人民醫(yī)院免疫科，內(nèi)蒙古 臨河051000）

目的：探討實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（FQ-PCR）檢測(cè)乙型肝炎病毒 DNA在臨床診斷中的價(jià)值．方法：對(duì)我院收治的190例乙型肝炎病毒感染患者的血清提取 DNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清中HBV-DNA，ELISA法測(cè)定 HBV血清標(biāo)記物．結(jié)果：FQ-PCR檢測(cè)的靈敏度和重復(fù)性良好，111例HBeAg（＋）／HBeAb（－）標(biāo)本中FQ-PCR均呈陽(yáng)性，HBV-DNA拷貝數(shù)1．04×107／mL，67例HBeAg（－）／HBeAb（＋）標(biāo)本中，陽(yáng)性率為58．2%，12例HBeAg（－）／HBeAb（－）標(biāo)本中，陽(yáng)性率為33．3%．結(jié)論：實(shí)時(shí)熒光定量 PCR可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量檢測(cè)HBV-DNA，可使診斷更準(zhǔn)確，治療更合理．

乙型肝炎病毒；熒光定量 PCR；免疫測(cè)定

0 引言

乙型肝炎是由乙肝病毒（HBV）引起的肝臟炎性病變，可引起多器官損害．該病是一類(lèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的世界性傳染疾病，屬于散發(fā)性疾病，一年四季均可發(fā)病，近年來(lái)發(fā)病趨勢(shì)一直上升［1］．實(shí)時(shí)熒光定量 PCR實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，是檢測(cè)乙肝病毒血癥最敏感的方法，與常規(guī) PCR相比，具有特異性更強(qiáng)、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于臨床疾病診斷［2］．本文對(duì) 190例乙型肝炎病毒核酸采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR法檢測(cè)，并與乙肝病毒標(biāo)志不同模式進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如下．

1 資料和方法

1．1 一般資料 選取我院 2013-06／2014-03傳染病科接診的 190例乙型肝炎病毒感染患者血清提取DNA，其中男123例，女67例，平均年齡34±5歲．

1．2 試劑與方法 采用 ELISA法檢測(cè) HBV免疫標(biāo)志物，匹基盒由上海信?？萍加邢薰咎峁?，嚴(yán)格按照匹基盒說(shuō)明書(shū)操作，采用酶標(biāo)儀進(jìn)行結(jié)果判斷［3］．

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)HBV-DNA，嚴(yán)格按照匹基盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，按照常規(guī)方法提取患者血清 HBV-DNA．具體操作為：取待測(cè)血清樣本和匹基盒中對(duì)照品各100 μL，10 000 r／min離心10 min；取上清液，加入100 μL DNA提取液 I，震蕩搖勻后，10 000 r／min離心10 min；棄上清，沉淀物中再加入25 μL DNA提取液 II，震蕩混勻，沸水浴 10 min，10 000 r／min離心10 min，取上清液備用［4］．取37．6 μL PCR反應(yīng)液加入0．2 mL離心管中，再加 0．4 μL Taq酶及0．06 μL尿苷酶作為反應(yīng)管，加入 2 mL處理樣本和對(duì)照品，設(shè)置對(duì)照品濃度梯度為 108，107，106，105，104，103copies／mL．

混勻后轉(zhuǎn)移至檢測(cè)區(qū)，采用核酸擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件為：93℃預(yù)變性 2 s，94℃預(yù)變性 5 s，60℃預(yù)變性30 s，共40個(gè)循環(huán)，引物和探針由上海生工生物工程公司合成（表 1）［5］．

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 STATA7．0統(tǒng)計(jì)分析軟件直線相關(guān)和回歸分析，對(duì)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＜0．05為差異具有顯著性．

2 結(jié)果

2．1 PCR的靈敏度和重復(fù)性 將對(duì)照品 10倍稀釋?zhuān)脤?shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1，以對(duì)數(shù)濃度為橫坐標(biāo)，循環(huán)次數(shù)為縱坐標(biāo)，具有良好的線性關(guān)系．將系列稀釋的對(duì)照品用熒光定量 PCR測(cè)定10次，每管重復(fù)3次，重復(fù)性結(jié)果見(jiàn)表2，表明PCR重復(fù)性良好．

表1 PCR所用引物和探針

圖1 HBV DNA的FQ-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 FQ-PCR的批內(nèi)和批間重復(fù)性

2．2 FQ-PCR檢測(cè)血清 HBV-DNA結(jié)果 血清HBV-DNA與 HBV標(biāo)記物 FQ-PCR檢測(cè)的結(jié)果見(jiàn)表3．

表3 HBV-DNA與HBV標(biāo)記物FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

臨床研究發(fā)現(xiàn)，急慢性肝炎的主要致病因子是乙型肝炎病毒（HBV），該病毒是一種 DNA病毒，對(duì)人和猩猩有易感性，引發(fā)乙型病毒性肝炎疾病．我國(guó)有2億人感染乙型肝炎病毒，且每年都呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，臨床資料顯示部分乙肝患者能夠形成持久免疫力，清除體內(nèi)乙肝病毒，形成慢性感染患者，大多患者逐步演化為肝硬化，甚至肝癌．目前臨床診斷 HBV感染最敏感的方法是 PCR技術(shù)，能夠準(zhǔn)確反映感染情況，縮短感染后的窗口期，PCR擴(kuò)增技術(shù)能夠準(zhǔn)確檢測(cè)一些血清學(xué)指標(biāo)陰性的突變株DNA［6］．本文研究結(jié)果表明，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)HBV-DNA具有較高的靈敏性和良好的重復(fù)性．ELISA方法檢測(cè) HBV血清是診斷 HBV感染的標(biāo)志性方法，具有高靈敏性和準(zhǔn)確性，可以間接反映 HBV的表達(dá)和復(fù)制，臨床檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血清HBeAg陽(yáng)性是HBV復(fù)制活躍、傳染性強(qiáng)的標(biāo)志．本文研究結(jié)果表明，HBeAg陽(yáng)性患者血清HBV-DNA陽(yáng)性率及含量顯著高于其它患者（P＜0．005），HBeAg（＋）系統(tǒng)與HBeAg（－）系統(tǒng)比較，差異有顯著（P＜0．005）．綜上所述，ELISA法結(jié)合FQ-PCR技術(shù)能夠準(zhǔn)確研究 HBV感染的自然進(jìn)程，監(jiān)測(cè)患者對(duì)抗病毒治療的反應(yīng)，對(duì) HBV感染的診斷、療效判定等有重要的指導(dǎo)意義．

［1］韓俊英，曾瑞萍．熒光定量 PCR技術(shù)及其應(yīng)用［J］．國(guó)外醫(yī)學(xué)：遺傳學(xué)分冊(cè)，2000，23（3）：117－120．

［2］蔡葉琴，孫 彥，黃 黎．血清HBV－DNA與HBV免疫學(xué)標(biāo)志物之間的相關(guān)性研究［J］．河北醫(yī)學(xué)，2011，17（2）：153－155．

［3］黃四爽，熊 勤．乙型肝炎病毒核酸實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)在臨床診斷中的價(jià)值［J］．?dāng)?shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志，2012，25（4）：484－485．

［4］陳素玲，胡國(guó)齡，譚德明．381例HBV感染者 HBV DNA前 C區(qū)基因突變的研究［J］．中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2001，11（8）：48－50．

［5］Pas SD，F(xiàn)ries E，De Man RA，et al．Development of a quantitative real-time detection assay for hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays［J］．J Clin Microbiol，2000，38（8）：2897－2901．

［6］周 丹．乙型肝炎病毒DNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)在臨床診斷中的價(jià)值［J］．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，7（20）：2271－2272．

The value of real-time fluorescence quantitative PCR in clinical diagnosis of HBV DNA

WEI Liu-Zhu
Department of Immunology，Linhe People's Hospital，Linhe 051000，China

AIM：To explore the value of the real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction（FQ-PCR）in clinical detecting heptitis B virus（HBV）DNA．METHODS：The sera from 190 patients were measured by FQ-PCR，and the plasma markers were detected by ELISA．RESULTS：The detection sensitivity and reproducibility of FQ-PCR are excellent．There were 111 patients that the FQ-PCR results of HBeAg（＋）／HBe-Ab（－）samples were positive，with 1．04×107／mL of HBVDNA copy on the average．In the 67 patients'HBeAg（－）／HBe-Ab（＋）samples，the positive rate was 58．2%．In the 12 patients'HBeAg（－）／HBeAb（－）samples，the positive rate was 33．3%．CONCLUSION：FQ-PCR can ensure the accurate and quantitative HBV-DNA detection，accurate diagnosis and reasonable treatment．

HBV；fluorescence quantitative PCR；immunoassay

R512．6＋2

A

2095-6894（2015）01-134-02

2014-11-18；接受日期：2014-12-04

魏留柱．大專(zhuān)，主管檢驗(yàn)師．研究方向：臨床檢驗(yàn)．Tel：0478-8295982 E-mail：weifanchengw@163．com