復(fù)配逆膠束體系中漆酶催化性能研究

馬玉杰，袁興中*，彭 馨，劉 歡，包 姍，吳秀蓮，曾光明（1.湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410082；2.湖南大學(xué)環(huán)境生物與控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410082）

復(fù)配逆膠束體系中漆酶催化性能研究

馬玉杰1，2，袁興中1，2*，彭 馨1，2，劉 歡1，2，包 姍1，2，吳秀蓮1，2，曾光明1，2（1.湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410082；2.湖南大學(xué)環(huán)境生物與控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410082）

在由鼠李糖脂和Tween-80構(gòu)建而成的復(fù)配逆膠束媒介研究了漆酶的催化性能.采用紫外法考察了Tween-80摩爾含量、逆膠束含水量、水相酸堿度、水相鹽度以及助表面活性劑種類等反應(yīng)條件對(duì)漆酶催化性能的影響.研究結(jié)果表明，反應(yīng)的最佳條件:Tween-80的摩爾含量為30%，體系含水量為20，緩沖溶液pH為4.5，KCI濃度為70mmol/L，助表面活性劑正己醇.并且在最佳條件下，漆酶在復(fù)配逆膠束體系中的酶活比在單相鼠李糖脂逆膠束中高1.44倍，比在水溶液中高4.35倍，研究結(jié)果表明復(fù)配表面活性劑在構(gòu)建膠束酶學(xué)上具有很大的潛力.

復(fù)配逆膠束；鼠李糖脂；Tween-80；漆酶；催化性能

同傳統(tǒng)化學(xué)表面活性劑相比，鼠李糖脂作為一種環(huán)境友好型的天然表面活性劑，產(chǎn)生于微生物動(dòng)物或植物的代謝過程中，具有低毒性、可生物降解性、生態(tài)相容性以及一定的膠團(tuán)催化能力等優(yōu)點(diǎn)［15-16］，其對(duì)于推進(jìn)逆膠束酶體系的應(yīng)用意義重大.陰離子表面活性劑——鼠李糖脂，與酶具有強(qiáng)烈的靜電和疏水作用，導(dǎo)致其在逆膠束中的活性和穩(wěn)定性降低［17-18］.為解決這一難題，通常是加入非離子表面活性劑，減弱逆膠束體系的靜電作用與疏水性，從而減弱酶與表面活性劑的相互作用［5，13］.非離子表面活性劑Tween-80具有低毒、易生物降解、與離子型表面活性劑具較好協(xié)同性等特點(diǎn).然而，目前向鼠李糖脂逆膠束體系中加入非離子表面活性劑Twenn-80以形成復(fù)配逆膠束體系來提高酶的催化性能的研究至今仍未見報(bào)道.

本文選擇鼠李糖脂和Tween-80進(jìn)行復(fù)配，以異辛烷為連續(xù)相，短鏈醇為助表面活性劑，與水構(gòu)成復(fù)配逆膠束體系.本實(shí)驗(yàn)采用單因素法分別考察了非離子表面活性劑的摩爾含量、pH值、W0、離子濃度、助表面活性劑種類等重要因素對(duì)漆酶催化活性的影響，以確定鼠李糖脂/ Tween-80復(fù)配逆膠束體系的最佳狀態(tài)為其推廣到工業(yè)應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).此研究拓展了酶反應(yīng)的媒介，這對(duì)于構(gòu)建適合于膠束酶學(xué)研究的逆膠束體系言有突出的實(shí)際意義.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ABTS（Sigam公司）；鼠李糖脂（湖州紫金生物科技有限公司）；Tween-80（天津市化學(xué)試劑三廠）；漆酶（Sigam公司）；異辛烷、正己醇、正丁醇、正戊醇、正辛醇、正庚醇、檸檬酸、檸檬酸鈉、無水乙醇和KCl等試劑均為市售分析純.超純水本實(shí)驗(yàn)室自制.

紫外分光光度計(jì)（Shimadzu UV-2552， Japan）；超聲波清洗儀；pH計(jì)（PHS-2F，上海雷磁儀器廠）；磁力攪拌器.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 復(fù)配逆膠束體系的制備 有機(jī)溶劑能夠影響到逆膠束水核中酶的活性和穩(wěn)定性，有研究證明相對(duì)于己烷和辛烷等有機(jī)溶劑，異辛烷對(duì)逆膠束中酶的性質(zhì)影響最小，酶在異辛烷體系中的活性最高［19］.以鼠李糖脂和Tween-80為表面活性劑，異辛烷為油相，短鏈醇為助表面活性劑，100mmol/L的一定pH值和KCI濃度的檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖溶液作為水相，配制復(fù)配逆膠束.逆膠束的含水量以W0（無量綱，其大小等于水的摩爾數(shù)與總表面活性劑摩爾數(shù)之比）來表示.

1.2.2 漆酶酶活測定 取10μL 0.5mg/mlABTS加入不同參數(shù)的逆膠束溶液中，用分光光度計(jì)（Shimadzu UV-2550，Japan）測420nm處吸光度的變化，繪制酶活隨非離子表面活性劑的摩爾分?jǐn)?shù)、W0、pH值、離子強(qiáng)度以及助表面活性劑的種類變化的圖形.每個(gè)實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行，取平均值，實(shí)驗(yàn)溫度（29±1）℃.定義1個(gè)酶活力單位（U）為1umol的ABTS每min被轉(zhuǎn)化所需的酶量.

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1.2.3 相對(duì)酶活計(jì)算 以緩沖溶液中漆酶活性為對(duì)照，對(duì)照組的酶活設(shè)為100%.相對(duì)酶活=（不同參數(shù)組的酶活性/對(duì)照組酶活性）X100%.

2 結(jié)果與討論

2.1 Tween-80對(duì)漆酶活性的影響

研究表明，在逆膠束體系中加入適量的非離子表面活性劑有利于提高酶的催化活性［14，20-21］.非離子表面活性劑的加入增大了界面膜面積，降低了界面電荷密度和界面膜的剛性，促進(jìn)底物與酶的活性位點(diǎn)接觸，從而提高酶的催化性能［14］.保持表面活性劑總濃度為0.05mol/L，考察Tween-80的摩爾分?jǐn)?shù)［x（Tween-80）］對(duì)酶活性的影響，如圖1所示.

從圖1可以看出，酶活性隨x（Tween-80）的增大，先增大后減小.在x（Tween-80）為0%時(shí)，體系為單相鼠李糖脂逆膠束系統(tǒng)，漆酶的最大酶活為1.69U；在x（Tween-80）＞0%時(shí)，體系為復(fù)配逆膠束系統(tǒng)，漆酶的最大活性為4.13U，后者比前者高出1.44倍.在x（Tween-80）為30%時(shí)，活性達(dá)到最大，相對(duì)酶活為5.35，酶活性比在水溶液中提高了4.35倍.這一方面是由于Tween-80吸附在膠束界面上，減小了界面上的電荷密度及逆膠束的疏水性，減弱了酶分子與鼠李糖脂分子極性頭的靜電作用以及酶分子與逆膠束之間的疏水作用對(duì)酶活性產(chǎn)生的不利影響；另一方面Tween-80分子中的聚氧乙烯鏈可以與酶分子以氫鍵相結(jié)合［13］，從而減弱酶分子與鼠李糖脂分子的相互作用.因此，在一定范圍內(nèi)隨著x（Tween-80）的增加，逆膠束的表面電荷的逐漸降低有利于酶的吸附，從而有利于底物與酶結(jié)合，所以酶活逐漸增大.然而Tween-80具有乳化作用，用量過大時(shí)會(huì)出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，使逆膠束的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，酶在逆膠束中的溶解能力降低，酶活性也隨之降低.選用x（Tween-80）=30%進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

圖1 Tween-80的摩爾分?jǐn)?shù)對(duì)復(fù)配逆膠束體系中漆酶催化性能的影響Fig.1 Effect of x（Tween-80） on activity of laccase in the mixed reversed micelles system

2.2 W0對(duì)漆酶活性的影響

W0是影響逆膠束中酶活性的一個(gè)重要參數(shù)，其大小決定了逆膠束中心水核（表面活性劑分子疏水的非極性尾部指向有機(jī)溶劑，親水的極性頭部聚集形成的納米級(jí)中心水核［22］）尺寸的大小，從而影響酶的催化活力.研究表明，酶的催化反應(yīng)是在環(huán)繞著酶分子表面的水層內(nèi)進(jìn)行的，只有與酶蛋白緊密結(jié)合的一層水分子對(duì)酶的催化活力才是重要的［23］.在W0為10～30范圍內(nèi)研究了其對(duì)酶活性的影響，其結(jié)果如圖2所示.

研究結(jié)果表明，當(dāng)W0較小時(shí)（＜15），逆膠束中心水核尺寸較小，酶分子的構(gòu)象受到逆膠束微粒的限制，結(jié)構(gòu)運(yùn)動(dòng)的自由度相對(duì)較小，酶的構(gòu)象變化受到限制，使酶不易轉(zhuǎn)化為催化構(gòu)象，酶的活力較低［24］.同時(shí)在W0較小的情況下，酶分子不能完全溶于逆膠束中心水核中，過多的酶分子暴露于有機(jī)溶液中，會(huì)降低酶的活性和穩(wěn)定性.當(dāng) 15≤W0≤20時(shí)，酶的活性隨W0的增加變化較緩慢并且保持良好催化性能.這是由于隨著W0的增加，逆膠束中心水核尺寸增大，不僅有利于酶的催化構(gòu)象的轉(zhuǎn)變，而且有利于酶分子被水和表面活性劑分子包裹，避免直接暴露于有機(jī)溶劑而失活酶［5］.當(dāng)W0大于20時(shí)，隨著W0的增大酶的活性逐漸減小，這一方面是由于膠束內(nèi)部水含量增加，會(huì)引起酶流動(dòng)性的增大，從而導(dǎo)致酶催化構(gòu)象的破壞，另一方面是由于當(dāng)W0繼續(xù)增大時(shí)，逆膠束中心水核中水的活增大，將影響酶的活性［13］.與酶活相比，相對(duì)酶活的變化趨勢比較明顯，在W0=20時(shí)，相對(duì)酶活達(dá)到最大.綜合考慮酶活和相對(duì)酶活，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均采用W0=20.

圖2 含水量W0對(duì)復(fù)配逆膠束中漆酶催化性能的影響Fig.2 Effect of W0 on the catalytic performance of laccase in mixed reversed micelles system

2.3 pH值對(duì)漆酶活性的影響

在逆膠束體系中酶分子所處微環(huán)境的pH值決定了其所帶電荷的種類.因此，pH值不僅影響酶分子在逆膠束體系中的溶解度和催化構(gòu)象，而且也有可能改變酶分子與逆膠束表面活性劑層之間的相互作用［25］.逆膠束微水相過高或過低的pH值條件都會(huì)引起酶活性的喪失，酶分子活性中心周圍的離子基團(tuán)只有在特定的酸堿度下才具有酶催化反應(yīng)的最佳離子態(tài).考察逆膠束水相pH值的改變對(duì)漆酶催化性能的影響，其結(jié)果如圖3所示.

當(dāng)pH＜4.5時(shí)，隨著pH值的增加，表面活性劑與酶分子之間的靜電作用逐漸減小，酶的溶解度以及活性逐漸增強(qiáng)；當(dāng)逆膠束內(nèi)表面電荷即表面活性劑極性基團(tuán)所帶的電荷與酶分子的等電點(diǎn)最接近時(shí)，二者產(chǎn)生靜電引力最小，酶的活性最大，此時(shí)pH=4.5；當(dāng)pH值繼續(xù)增加時(shí)，表面活性劑與酶分子之間的靜電作用又有所增加，酶活性隨之降低.這與文獻(xiàn)［26］報(bào)道相一致漆酶在逆膠束中的最佳pH值在4.2～4.5，非離子型表面活性劑對(duì)最佳pH值影響不大，而主要取決于酶本身的性質(zhì).

圖3 pH值對(duì)復(fù)配逆膠束中漆酶催化性能的影響Fig.3 Effect of pH on the catalytic performance of laccase in mixed reversed micelles system

2.4 KCl對(duì)漆酶活性的影響

反應(yīng)體系中緩沖液的離子強(qiáng)度影響酶的空間結(jié)構(gòu)，從而影響其催化能力.逆膠束中心水核鹽濃度主要通過改變逆膠束結(jié)構(gòu)和酶的空間結(jié)構(gòu)兩種方式來影響逆膠束中酶的催化性能，水相中的鹽離子能影響表面活性劑分子極性頭部間的靜電作用，從而引起逆膠束聚集體大小和數(shù)目的改變［27］.研究鹽濃度對(duì)復(fù)配逆膠束中漆酶催化性能的作用，如圖4所示.從圖4可以看出，當(dāng)鹽濃度較低時(shí)，酶活性開始隨離子強(qiáng)度增加而增加，最佳活性時(shí)離子強(qiáng)度為70mmol/L.適當(dāng)增加鹽濃度能縮小逆膠束中心水核的體積，增加逆膠束結(jié)構(gòu)的剛性，有利于溶解在其中的酶保持其催化活性［27］.隨后酶的活性下降，在高離子強(qiáng)度下，蛋白質(zhì)由于變性而使酶活性大為降低，所以活性降低.彭子原等［28］的研究結(jié)果，KCl為10mmol/L時(shí)，漆酶在鼠李糖脂逆膠束體系中的活性達(dá)到最大，與本實(shí)驗(yàn)相比，非離子表面活性劑的加入明顯提高了酶在逆膠束體系的耐鹽度.

圖4 KCI濃度對(duì)復(fù)配逆膠束中漆酶催化性能的影響Fig.4 Effect of KCl concentration on the catalytic performance of laccase in mixed reversed micelles system

2.5 不同醇種類對(duì)酶活性的影響

中短碳鏈的醇作為助表面活性劑，與表面活性劑分子共同組成界面層，使界面層上表面活性劑的數(shù)目減少，能調(diào)節(jié)表面活性劑的HLB值，增強(qiáng)體系的增溶能力，進(jìn)而改變酶在逆膠束體系中的催化性能［26］.除此之外，還可以改變表面活性劑的親水基之間的作用，松散表面活性劑分子的排列［29］，使酶分子更容易進(jìn)入逆膠束水核.采用正丁醇、正己醇、正庚醇、正辛醇及正戊醇等5種正構(gòu)醇作為助表面活性劑，分別加入有機(jī)相異辛烷中，探究助表面活性劑種類對(duì)漆酶催化性能的影響，其結(jié)果如圖5所示.

助表面活性劑能夠增加表面活性劑的溶解性，同時(shí)能夠促進(jìn)表面活性劑極性端的結(jié)合，形成逆膠束［30］.Jolivalt等［29］研究表明，增加助表面活性劑的碳鏈長度會(huì)導(dǎo)致表面活性劑分子頭部集團(tuán)之間的屏蔽作用降低，使得逆膠束體積變大，為酶催化反應(yīng)提高足夠的空間，提高酶的活性.正如本實(shí)驗(yàn)中正丁醇、正戊醇、正己醇作助表面活性劑時(shí)，醇的碳鏈增長，酶的活性依次增強(qiáng).張文娟等［31］認(rèn)為由于表面活性劑電荷性質(zhì)、頭基大小及醇在聚集體結(jié)構(gòu)中的定位等原因，醇對(duì)酶有激活作用，并且這種激活作用隨碳鏈長度的增加逐漸減小.由此，正庚醇和正辛醇對(duì)酶的激活作用弱于正己醇、正戊醇和正丁醇.上述原因的共同作用，從圖5看出，正己醇最適合作助表面活性劑.

圖5 助表面活性劑種類對(duì)復(fù)配逆膠束中漆酶催化性能的影響Fig.5 Effect of cosurfactant types on the catalytic performance of laccase in mixed reversed micelles system

3 結(jié)論

3.1 在最佳條件下鼠李糖脂/Tween-80復(fù)配逆膠束體系中漆酶的活性比在單相鼠李糖脂逆膠束中高出1.44倍，比在水溶液中高出4.35倍，漆酶在復(fù)配逆膠束體系中表現(xiàn)出了超活性，表面活性劑復(fù)配在膠束酶學(xué)中有巨大的潛力.

3.2 漆酶在復(fù)配逆膠束體系中表現(xiàn)出優(yōu)良的催化性能，其活性受到非離子表面活性劑的摩爾含量、含水量W0、水相酸堿度、水相鹽濃度、助表面活性劑等條件的影響.當(dāng)總體表面活性劑濃度為0.05mol/L，反應(yīng)的最佳條件:x（Tween-80）= 30%，含水量W0=20，水相pH值4.5，水相KCl濃度70mmol/L，助表面活性劑正己醇.

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Catalytic performance of laccase in mixed reversed micelle system.

MA Yu-jie1，2， YUAN Xing-zhong1，2*， PENG Xin1，2，LIU Huan1，2， BAO Shan1，2， WU Xiu-lian1，2， ZENG Guang-ming1，2（1.College of Environmental Science and Engineering，Hunan University， Changsha 410082， China；2.Key Laboratory of Environmental Biology and Pollution Control， Ministry of Education， Hunan University， Changsha 410082， China）. China Environmental Science， 2015，35（4）：1129～1134

A mixed reversed micelle system had been developed to investigate the catalytic performance of laccase. The anionic biosurfactant Rhamnolipid and nonionic surfactant Tween-80 were used to construct the mixed reversed micelle system， while the isooctane and short-chain alcohols （1:1， V/V） were used as oil phase and cosurfactant， respectively. UV spectrum was analysed to find out how the molar fraction Tween-80， water content， pH， ionic strength and cosurfactant stype affected enzyme activity of laccase in the mixed reversed micelle system. And it has been found that while the molar fraction Tween-80 was 30%， water content was 20， pH was 4.5， the concentration of KCl was 70mmol/L， cosurfactant stype was n-hexanol， the optimal condition of mixed reversed micelle system could be reached. In optimum catalytic conditions， the catalytic activity was higher 1.44 times in the mixed reversed micelle than that in the single Rhamnolipid reversed micelle system， and higher 4.35 times than that in water. The research indicated mixed reversed micelle has huge potential in micellar enzymology.

mixed reversed micelle system；Rhamnolipid；Tween-80；laccase；catalytic performance

X703.5

A

1000-6923（2015）04-1129-06

馬玉杰（1984-），女，河南周口人，湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院碩士研究生，研究方向?yàn)閺U物資源化.

2014-07-18

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（50978087）

* 責(zé)任作者， 教授， yxz@hnu.edu.cn