PKM2基因在非小細胞肺癌中表達及其與放療敏感性的關系

李宏敏安寧于瑞蓮何陽科鄧紅彬

·臨床研究與應用·

PKM2基因在非小細胞肺癌中表達及其與放療敏感性的關系

李宏敏①安寧①于瑞蓮①何陽科①鄧紅彬②

目的：研究PKM2在非小細胞肺癌組織中的表達及其與放療敏感性的關系。方法：選取2011年5月至2013年10月四川省人民醫(yī)院非小細胞肺癌120例患者，術后進行2個月的放射治療，按照療效將患者分為4組。RT-PCR檢測患者放療前手術切除的腫瘤組織和癌旁組織中PKM2 mRNA表達水平。Western blot和免疫組織化學檢測腫瘤組織和癌旁組織中PKM2蛋白表達。RT-PCR和Western blot方法檢測不同療效組PKM2表達水平。結果：非小細胞肺癌放療2個月后，治療有效率為49.2%。PKM2在非小細胞肺癌癌組織中表達顯著高于相應的癌旁組織。PKM2表達水平與患者放療療效呈負相關。結論：PKM2在非小細胞肺癌中表達高于癌旁組織，PKM2低表達患者對放療敏感性高。

非小細胞肺癌 PKM2 放療敏感性

肺癌是近年來全球范圍內發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率的上升速度也是惡性腫瘤中最高的。肺癌中約85%為非小細胞肺癌（NSCLC）［1］，其發(fā)病率在肺癌中居首位［2］，患者5年內生存率不足15%［3］。NSCLC作為放療中度敏感的惡性腫瘤之一，放射治療是其主要治療手段，約70%非小細胞肺癌患者需要接受放射治療［4］，一些NSCLC患者對放射療法不敏感，這成為治療最為重要的挑戰(zhàn)［5］。丙酮酸激酶（PK）是有氧糖酵解途徑的關鍵限速酶之一，PKM2是PK的一種異構體，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，并且在很多腫瘤的診斷、預后及治療方面有良好的臨床應用價值［6］，可作為惡性腫瘤患者的獨立預后因素。研究表明，PKM2低表達的結腸癌細胞對奧沙利鉑化療耐藥性增加［7］，并且敲減PKM2的表達可增強肺癌細胞化療敏感性［8］，可將其作為腫瘤治療的重要靶點。研究表明，PKM2可作為晚期非小細胞肺癌患者對鉑類化合物化療敏感性的預測生物學標記物［9］，因放射療法是NSCLC的主要治療手段，本研究旨在研究PKM2在NSCLC中的表達及與放療敏感性關系。

1 材料與方法

1.1材料

選取120例四川省人民醫(yī)院院2011年5月至

2013年10月確診的非小細胞肺癌120例患者作為試驗組，其中男性67例，女性53例，年齡4～76歲，平均年齡56.3歲。所有患者臨床資料齊全，未發(fā)生遠處轉移，心肺功能正常，均未接受放化療。

1.2方法

1.2.1治療方案所有患者術后2～4周均接受三維適形放射治療，2 Gy/次，5次/周，治療總劑量達50～70 Gy，進行為期8周的放射治療。根據(jù)WHO腫瘤療效評價標準判定療效，將患者分組為完全緩解組（CR）、部分緩解組（PR）、穩(wěn)定組（NC）和進展組（PD），有效率（RR）=CR+PR。

1.2.2組織RNA的提取放療前對手術切除的腫瘤組織樣本和相應的癌旁組織樣本，采用Qiagen組織RNA提取試劑盒（德國）進行組織RNA的提取。通過紫外分光光度計測定A260/A280后，計算RNA濃度，采用DEPC水調節(jié)所提的RNA至相同濃度。

1.2.3RT-PCR測定非小細胞肺癌及癌旁組織PKM2 mRNA表達美國Promega公司逆轉錄試劑盒將組織總RNA反轉成cDNA后，用TaqMan Gene Expression Assays（美國Applied Biosystems公司）檢測PKM2 mRNA的表達水平。PKM2基因上游引物：5'-GGGAGCCACTCT CAAAATCA-3'；下游引物：5'-ACCTTTTCTGCTTC ACCTGGA-3'。內參GAPDH上游引物：5'-TCAGTGGTG GACCTGACCTG-3'；下游引物：5'-TGCTGTAGC CAAATTCGTTG-3'。反應條件：94℃，5mim；60℃，30s；40個循環(huán)。

1.2.4Western blot檢測非小細胞肺癌及癌旁組織PKM2蛋白表達隨機選取4例非小細胞肺癌患者放療前手術切除的腫瘤組織樣本和相應的癌旁組織，采用Qiagen組織提取試劑盒進行組織總蛋白的提取。SDS-PAGE凝膠電泳分離，恒流300 mA轉移至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉2 h后，加入一抗（PKM2抗體購自美國Abcam公司），4℃孵育過夜。次日PBST洗膜，二抗室溫孵育2 h，PBST洗膜。用化學發(fā)光法顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集成像。

1.2.5免疫組織化學分析NSCLC及癌旁組織PKM2表達取患者放療前手術切除的腫瘤組織樣本和相應的癌旁組織，用10%甲醛固定4 h后石蠟包埋，切片5 μm厚度，脫蠟水化后用過氧化氫處理20 min，進行抗原修復，用PKM2抗體（購自美國Abcam公司）孵育過夜，PBS洗滌后二抗孵育40 min，DAB顯色，復染，封片。陽性表達判斷標準，每例隨機技術10個（×400）視野，以鏡下陽性細胞百分比和染色強度進行半定量評價。1）著色細胞數(shù)占細胞計數(shù)百分比＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。2）無染色為0分，染色強度淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩者相乘即陽性等級：0分為陰性，1～4分為弱陽性（+），5～8分為陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。

1.3統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1放療療效

8周放射治療后，120例患者中CR為24例，PR為35例，NC為37例，PD為24例，有效率（RR）為49.2%（59/120）。

2.2非小細胞肺癌及癌旁組織PKM2 mRNA、PKM2蛋白表達差異

通過RT-PCR分析，120例NSCLC患者放療前的癌組織中PKM2 mRNA表達的陽性率為70.8%（85/ 120），與對應的癌旁組織PKM2 mRNA表達的陽性率6.67%（8/120）相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.000 1），實時熒光定量PCR檢測結果顯示，癌組織中PKM2的表達與β-actin比值為6.24，癌旁組織PKM2的表達與β-actin比值為0.38（表1，圖1）。4例NSCLC患者Western blot結果顯示，癌組織樣本中PKM2高表達，對應的癌旁組織中PKM2表達量較低，幾乎不表達，見圖2。

表1 非小細胞肺癌及癌旁組織PKM2 mRNA表達差異Table 1Expression levels of PKM2 mRNA in tumor and normal tissues

2.4免疫組織化學檢測非小細胞肺癌及癌旁組織PKM2表達差異

免疫組織化學結果顯示（圖3），PKM2在非小細胞肺癌組織中表達情況為40例（-）、8例（+）、48例（++）、24例（+++），陽性率為66.7%（80/120），并且在細胞核及細胞質均有表達，而在癌旁組織中只在細胞質里有微量表達，見圖3，表達情況為104例（-）、12例（+）、4例（++）、0例（+++），陽性率為13.3%（16/ 120），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

圖1 非小細胞肺癌及癌旁組織PKM2 mRNA表達差異Figure 1Expression levels of PKM2 mRNA in tumor and normal tissues

圖2 非小細胞肺癌及癌旁組織PKM2蛋白表達差異Figure 2Expression levels of PKM2 protein in tumor and normal tissues

圖3 非小細胞肺癌及癌旁組織PKM2表達檢測（DAB×40）Figure 3Expression levels of PKM2 in tumor and normal tissues（DAB×40）

2.5RT-PCR測定不同放療療效組治療前腫瘤樣本PKM2 mRNA表達差異

RT-PCR結果顯示，放射治療前，與所有患者PKM2 mRNA表達的均值6.24±0.27相比，療效最好的CR組在治療前，PKM2 mRNA表達水平最低3.05±0.21，而放療無效組（NC/PD）PKM2 mRNA的表達量較高，PKM2 mRNA水平與放療療效呈負相關（表2，圖4）。

?*.compared with the former group P＜0.01圖4不同放療療效組治療前腫瘤樣本PKM2 mRNA表達Figure 4Expression levels of PKM2 mRNA in tumor tissues in different groups before radiotherapy

2.6不同放療療效組治療前腫瘤樣本PKM2蛋白表達差異

通過Western blot分析，療效最好的CR組在治療前PKM2蛋白表達水平最低，而放療無效組（NC/PD）PKM2蛋白的表達量較高，PKM2蛋白水平與放療療效呈負相關，這與mRNA檢測結果相一致，說明低表達的PKM2患者對放射療法更敏感（圖5）。

2.7不同放療療效組治療前腫瘤樣本PKM2免疫組織化學陽性率差異

本研究統(tǒng)計了放療前不同療效組腫瘤樣本免疫組織化學PKM2表達的陽性率。結果顯示，與所有患者PKM2表達陽性率（66.7%）相比，療效最好的CR組在治療前PKM2表達的陽性率最低（45.8%），而放療無效組（NC/PD）PKM2表達的陽性率較高，PKM2在非小細胞肺癌中表達的陽性率與放療療效呈負相關（表3）。

表2 不同放療療效組治療前腫瘤樣本PKM2 mRNA表達Table 2Expression levels of PKM2 mRNA of tumor tissues in different groups before radiotherapy

圖5 不同療效組治療前腫瘤樣本PKM2蛋白表達Figure 5Expression levels of PKM2 protein of tumor tissues in different groups before radiotherapy

3 討論

糖代謝異常是腫瘤細胞的重要特點之一，無論是否有氧氣存在，腫瘤細胞都依賴糖酵解進行代謝，即Warburg效應。M2型丙酮酸激酶PKM2是Warburg效應中一個關鍵的限速酶，在腫瘤中表達量較高［10］。研究表明，PKM2高表達能夠通過增強Warburg效應而促進腫瘤生長［11］，惡性腫瘤患者血清中PKM2的表達水平顯著升高，并與腫瘤的分化轉移和分期有關［12］，且治療有效時其濃度下降，可以將其作為惡性腫瘤診斷和預后預測的重要指標［6］。肺癌是目前全球范圍內惡性腫瘤之一，我國肺癌的發(fā)病率和死亡率居所有癌癥的首位，非小細胞肺癌是最常見的肺癌類型，也是肺癌治療的重點［13］。放療是其重要的臨床治療手段，但不同個體對腫瘤的放療敏感性不同，相同放射劑量下有的患者治療無效，會導致延誤病情，若能在治療前預測患者放療敏感性則可對不同患者進行個性化治療［14］。研究表明PKM2可作為晚期非小細胞肺癌患者對鉑類化合物化療敏感性的預測生物學標記［9］，但目前關于PKM2與非小細胞肺癌放療敏感性相關報道較少。

為驗證PKM2在非小細胞肺癌中的表達，本研究首先檢測了120例非小細胞肺癌患者癌組織和癌旁組織中PKM2 mRNA以及蛋白表達水平。結果顯示，PKM2在癌組織中普遍高表達，而在癌旁組織中表達量較低幾乎不表達，這與之前在其他腫瘤中PKM2表達上調的報道相一致，并且免疫組織化學的結果顯示，PKM2在癌旁組織細胞質中只有輕微表達，而在肺癌組織細胞核和胞漿均有表達，說明PKM2在非小細胞肺癌發(fā)展過程中會發(fā)生由細胞質向細胞核的轉移，這與之前在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)的PKM2向細胞核轉移的報道相符［15］。提示PKM2在非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展及病情預示中可能發(fā)揮著重要作用。

本研究分別檢測了不同放療療效組在接受治療前其癌組織中PKM2的表達水平，研究PKM2與非小細胞肺癌放療敏感性的關系，結果顯示，放療療效最好的CR組腫瘤組織中PKM2的表達水平較其他組低，其他療效組PKM2的表達水平也隨著療效的降低而增加，提示PKM2的表達水平與患者對放射線的敏感性密切相關，即PKM2表達水平低的患者，對放射線較為敏感，放療療效和預后良好。在對采取標準手術治療、放化療的55例膠質母細胞瘤患者預后統(tǒng)計中發(fā)現(xiàn)，PKM2表達較低的患者中位生存期為34.5個月，相比之下具有高水平PKM2的患者中位生存期僅為13.6個月［16］。這與本研究的療效好的治療組患者PKM2表達水平低的結果相符。分析其潛在的機制，研究發(fā)現(xiàn)沉默PKM2的表達會降低前列腺癌細胞PC2中cyclin D1和c-myc基因的表達［17］，cyclin D1和c-myc是重要的細胞周期調控蛋白，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要作用，因此推測，PKM2表達量低的腫瘤細胞中，cyclin D1和c-myc表達量受到限制，導致細胞增長減慢，對于同樣的放射劑量，其細胞凋亡的比例明顯高于細胞增殖，使其對放射線敏感性提高；而在PKM2高表達的腫瘤細胞中，cyclin D1和c-myc表達升高，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，對于同樣的放射劑量，相對于PKM2低表達的腫瘤細胞，其細胞凋亡的比例明顯降低，導致其對放射線敏感性降低。

綜上所述，PKM2在非小細胞肺癌的腫瘤組織中表達上調并發(fā)生由細胞質向細胞核轉移，且其表達水平與患者對放射線的敏感性呈負相關，可以將其作為預測放療療效的重要指標，但PKM2向細胞核轉移以及增強放療敏感性的具體機制有待在細胞水平上進行相關基因表達驗證，以及PKM2免疫熒光及敲減等進一步實驗研究。能否將其作為非小細胞肺癌治療的重要靶點也有待進一步的探索，期望將PKM2作為對非小細胞肺癌放療療效的重要預測指標，實現(xiàn)非小細胞肺癌患者的個性化治療。

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（2015-01-08收稿）

（2015-03-03修回）

（編輯：楊紅欣）

Expression of pyruvate kinase M2 in non-small cell lung cancer and its correlation with radiation sensitivity

Hongmin LI1，NingAN1，Ruilian YU1，Yangke HE1，Hongbin DENG2

Hongbin DENG；E-mail：hongbindeng_2014@126.com

Objective：To investigate the expression level of pyruvate kinase M2（PKM2）in tissues of non-small cell lung cancer（NSCLC）patients and the correlation between PKM2 expression level and radiation sensitivity.Methods：A total of 45 NSCLC patients were chosen and treated with radiotherapy for two months after surgery.The patients were classified into four groups based on the curative effect.The mRNA expression levels of PKM2 in tumor and the homologous paraneoplastic tissues of NSCLC patients were detected prior to radiotherapy using real time-polymerase chain reaction（RT-PCR），and the protein expressions of PKM2 in the tumor and paraneoplastic tissues of NSCLC patients were detected with Western blot analysis and immunohistochemical method.The mRNA and protein expression levels of PKM2 in the tumor tissues of different groups were detected with RT-PCR and Western blot assays.Results：The effective rate of radiotherapy for 2 months is 44.8%in NSCLC patients.The expression level of PKM2 is significantly higher in tumor tissues than in homologous paraneoplastic tissues of NSCLC patients and is negatively correlated with the curative effect of radiotherapy.Conclusion：The expression level of PKM2 is significantly higher in tumor tissues than in the paraneoplastic tissues of NSCLC patients.Patients with lower PKM2 expression level are more sensitive to radiotherapy.

non-small cell lung cancer，PKM2，radiation sensitivity

10.3969/j.issn.1000-8179.20150041

①四川省人民醫(yī)院腫瘤科（成都市610072）；②重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科

鄧紅彬hongbindeng_2014@126.com

1Department of Oncology，Sichuan Provincial People's Hospital，Chendu 610072，China；2Department of Oncology，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China

李宏敏專業(yè)方向為腫瘤的綜合治療。

E-mail：wxy_0010@163.com