酶解法提取葡萄酒泥中白藜蘆醇工藝研究

史秋蘭 周艷春 趙儉波 劉建剛

摘 要：研究采用酶解法從葡萄酒泥中提取白藜蘆醇，探索其最佳提取工藝，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以酶濃度、酶解溫度、酶解時間為因素進行正交試驗。結(jié)果表明：酶濃度、酶解時間對白藜蘆醇的提取效果有顯著影響，最佳提取工藝條件為pH值4.0，酶濃度1.5mg/g，酶解溫度40℃，酶解時間75min，在此條件下白藜蘆醇提取量為80.2μg/g。

關(guān)鍵詞：酶解法；葡萄酒泥；白藜蘆醇；工藝優(yōu)化

中圖分類號 O636.2 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）21-35-03

Technology for Extracting Resveratrol from Wine Mud through Enzymatic Hydrolysis

Shi Qiulan1 et al.

（1Alar Quality and Technical Supervision Bureau，Alar 843300，China）

Abstract：Resveratrol was extracted from wine mud by alcohol precipitation method with the assistance of enzymolysis，and optimum extraction was explored. The effects of enzyme concentration，enzymatic hydrolysis temperature，and time on the yields of resveratrol were studied by single factor and orthogonal array design methods. The result is that enzyme concentration and hydrolysis time have a significant impact on the effectiveness of resveratrol extract，and the optimum extraction conditions are as follows：pH value 4.0，enzyme concentration 1.5mg/g，enzymatic hydrolysis temperature 40℃ and hydrolysis time 75min. Under such conditions，the yield of resveratrol is 80.2μg/g.

Key words：Wine mud；Resveratrol；Enzymatic hydrolysis；Process optimization

白藜蘆醇（resveratrol，簡稱Res）又稱芪三酚，化學名稱為3，4′，5-三羥基二苯乙烯，是植物受到病原性進攻和環(huán)境惡化時體內(nèi)產(chǎn)生的一種次生代謝產(chǎn)物[1]。1963年，Nonomura等[2]提出白藜蘆醇是某些草藥治療炎癥、脂類代謝和心臟疾病的有效成分后，各國科研工作者陸續(xù)提出白藜蘆醇具有改善心腦血管循環(huán)，抗氧化、抗衰老，抗病毒、保肝，抗腫瘤、抗癌等藥理及生物學作用[3-5]。白藜蘆醇的制備多從天然植物虎帳、葡萄皮、花生中提取[6-8]，近期的研究發(fā)現(xiàn)，葡萄酒泥中含有較豐富的白藜蘆醇，含量為28.63～80.48μg/g[9]。目前，大部分葡萄酒泥被當做飼料或肥料使用[10]，利用率極低，更有部分被隨意排放，造成環(huán)境污染。本研究以葡萄酒泥為原料，以乙醇作為提取劑，采用酶解法提取白藜蘆醇，以期為白藜蘆醇原料的開發(fā)和葡萄酒泥的綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器 葡萄酒泥由新疆鄉(xiāng)都酒業(yè)有限公司提供，為泥狀物，經(jīng)3 000r/min離心，棄去上層清液，沉淀物自然晾干，粉碎之后過80目篩備用；纖維素酶由上海藍季科技發(fā)展有限責任公司提供；白藜蘆醇標準品由美國Sigma公司提供；無水乙醇、甲醇、乙酸乙酯等均為AR，由天津市天津市致遠化學試劑有限公司提供。UV2000紫外可見分光光度計，日本島津；756紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；PL303電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海東璽制冷儀器設備有限公司；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 白藜蘆醇測定方法[11] 準確稱取白藜蘆醇標準品0.1g，用甲醇溶解，并定容到10mL，搖勻，備用，得白藜蘆醇對照品儲備液。取白藜蘆醇對照品儲備液置于1cm比色皿中，以甲醇為參比，用紫外分光光度計在200～800nm波長間掃描，該標準溶液在306nm處有最強吸收峰。移取不同體積白藜蘆醇對照品儲備液置于10mL容量瓶中，配制成一系列不同濃度的標準溶液，于306nm處測定吸光度值，繪制標準曲線，以對照品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得回歸線方程y=0.5624x-0.0347（R2=0.994 2），線性范圍為0.3～1.59μg/mL。式中：y為吸光度值，x為白藜蘆醇質(zhì)量濃度。

1.3 白藜蘆醇提取方法 稱取一定量葡萄酒泥粉末至錐形瓶中，加入適量水和纖維素酶在一定的溫度、一定的pH值下酶解一定時間，酶解后加入150mL70%乙醇，于70℃恒溫提取1h后抽濾，收集濾餅，得白藜蘆醇粗品。然后將此粗品用甲醇溶解、定容，并稀釋適當倍數(shù)后測定提取液的吸光度，由回歸線性方程得出白藜蘆醇提取量，公式如下：

提取量（μg·g-1）=提取液中白藜蘆醇質(zhì)量濃度×提取液體積/葡萄酒泥質(zhì)量

經(jīng)分析后確定酶解溫度、酶用量和酶解時間是酶解法影響白藜蘆醇提取量的主要因素，采用單因素實驗和正交試驗探討白藜蘆醇提取最佳實驗條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 酶濃度對白藜蘆醇提取率的影響 在酶解溫度為40℃，緩沖液pH值4.0條件下，分別添加濃度為0.5mg/g、1.0mg/g、1.5mg/g、2.0mg/g、2.5mg/g、3.0mg/g的纖維素酶，酶解60min。不同酶濃度對白藜蘆醇提取量的影響如圖1所示。由圖1可知，隨著酶濃度的增加，白藜蘆醇的提取量也增大，當酶濃度為1.5mg/g時，白藜蘆醇的提取量達到最大，此后隨著酶濃度的增加，白藜蘆醇的提取量略有下降。這可能是由于原料與酶分子的結(jié)合數(shù)量是有限的，當酶濃度較低時，酶分子與底物充分結(jié)合，酶濃度若過高，則過量的酶分子不利于分子定向運動，酶活性反而降低[12]。

2.1.2 酶解溫度對白藜蘆醇提取率的影響 在緩沖液pH值4.0條件下，添加濃度為1.5mg/g的纖維素酶，分別在溫度30～55℃酶解60min。不同酶解溫度對白藜蘆醇提取量的影響如圖2所示。由圖2可知，隨著溫度的增加，白藜蘆醇的提取量也增大，當酶解溫度達到45℃時，提取量達到最大，此后再隨著酶解溫度的增加，白藜蘆醇的提取量呈下降趨勢。在酶解反應中，溫度不僅影響反應速度，而且影響酶的活性，溫度升高，酶的活性降低，且白藜蘆醇是熱敏性物質(zhì)，高溫下易被氧化[13]。

2.1.3 酶解時間對對白藜蘆醇提取率的影響 在酶解溫度為45℃，緩沖液pH值4.0條件下，添加濃度為1.5mg/g的纖維素酶，分別酶解20～100min。酶與原料結(jié)合發(fā)生酶解反應需要一定的時間，由圖3可知，隨著酶解時間的延長，白藜蘆醇提取量也隨之增大，酶與原料充分結(jié)合后再延長時間，提取量變化不大。因此，確定酶解時間為60min。

2.1.4 pH值對對白藜蘆醇提取率的影響 在酶解溫度為45℃條件下，分別在pH值為2～7的溶液中添加濃度為1.5mg/g的纖維素酶，酶解60min。不同pH值對白藜蘆醇提取量的影響如圖4所示。大多數(shù)的酶的活性對環(huán)境pH的影響較大，pH的改變會破壞酶的結(jié)構(gòu)，從而使酶的活性降低，影響酶解反應。由圖4可知，白藜蘆醇提取量在pH值為4.0時最大。

2.2 酶解法提取葡萄酒泥中白藜蘆醇正交試驗 根據(jù)單因素試驗的研究結(jié)果，將酶濃度、酶解溫度和酶解時間作為考察因素，采用L9（33）正交試驗對白藜蘆醇酶解工藝進行優(yōu)化。試驗因素與水平見表1，試驗結(jié)果見表2。

由表3正交試驗方差結(jié)果可知，在90%可信度時，因素A和C對白藜蘆醇提取量影響顯著。結(jié)合表2極差（R）分析可以看出，各因素對結(jié)果的影響主次順序為：A>C>B，最佳工藝組合為A2B1C3，即酶濃度為1.5mg/g，酶解溫度為40℃，酶解時間為75min。按此最佳條件進行提取，白藜蘆醇提取量為80.2μg/g（n=3），RSD值為0.45%，此優(yōu)化條件具有重復性、可靠性。

3 結(jié)論

本實驗以乙醇為提取劑采用酶解法提取葡萄酒泥中的白藜蘆醇，通過單因素試驗和正交試驗得出較佳的酶解工藝條件為pH4.0，酶濃度1.5mg/g，在40℃下酶解75min，白藜蘆醇提取量為（80.2±0.33）μg/g。

參考文獻

[1]韓晶晶，劉煒，畢玉平.白藜蘆醇的研究進展[J].生物工程學報，2008，24（11）：1851-1859.

[2]Nonomura S，Kanagawa H，Makimoto A.Chemical constituents of polygonaceous plants. I. Studies on the components of Ko-jo-kon（Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.）[J].Yakugaku Zasshi，1963，83：988-990.

[3]Jang M，Pezzuto J.Effect of resveratrol on 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate induce oxidative evevts and gene expression in mousekin. Cancer Lett，1998，134（1）：81-89.

[4]金順姬，段鏈，黃梅，等.白藜蘆醇和抗壞血酸對預防非典型肺炎方劑Ⅰ和Ⅵ所致小鼠外周血液淋巴細胞DNA損傷的保護作用[J].中草藥，2003，34（12）：114-117.

[5]羅莉，黃憶明.白藜蘆醇對老年性癡呆小鼠認知功能的影響[J].中南大學學報（醫(yī)學版），2006，31（4）：566-569.

[6]魏萌，王水興，陸豫.虎杖中的白藜蘆醇分離、提取及HPLC 檢測的研究[J].食品科技，2006，31（8）：118-120.

[7]劉婷，王燕，李韻，等.響應面法優(yōu)化超臨界CO2萃刺葡萄酒渣中白藜蘆醇工藝[J].食品工藝研究，2015，36（4）：193-198.

[8]張初署，禹山林，潘麗娟，等.響應面法優(yōu)化花生根中白藜蘆醇提取工藝研究[J].食品科學，2009，30（6）：34-38.

[9]趙儉波，沈紅玲，王偉，等.葡萄酒泥與慕薩萊斯酒泥營養(yǎng)成分的比較分析[J].食品工業(yè)，2015，36（5）：295-297.

[10]高學峰，楊繼紅，王華，等.葡萄及葡萄酒生產(chǎn)過程中副產(chǎn)物的綜合利用研究進展[J].食品科學，2015，36（7）：289-295.

[11]劉大川，劉強，吳波，等.花生紅衣中白藜蘆醇、原花色素提取工藝的研究[J].食品科學，2005，26（7）：144-148.

[12]張圣燕.纖維素酶在天然產(chǎn)物提取中的應用研究[J].廣東化工，2011，38（9）：59-60.

[13]錢時權(quán)，石亞中，伍亞華，等.纖維素酶-超聲波輔助有機溶劑提取山葡萄中白藜蘆醇的研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33（3）：210-213.

（責編：張宏民）