酶聯(lián)適體分析法檢測葡萄酒中的赭曲霉素A

趙秋伶，史素青

（1.遼寧工程技術(shù)大學(xué)礦業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧葫蘆島 125105；2.西北大學(xué)化學(xué)與材料學(xué)院，陜西西安 710069）

酶聯(lián)適體分析法檢測葡萄酒中的赭曲霉素A

趙秋伶1，史素青2

（1.遼寧工程技術(shù)大學(xué)礦業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧葫蘆島 125105；2.西北大學(xué)化學(xué)與材料學(xué)院，陜西西安 710069）

建立了競爭取代酶聯(lián)適體分析方法，檢測葡萄酒中的赭曲霉素A（OTA）。核酸適體和OTA特異性結(jié)合導(dǎo)致與核酸適體雜交的短鏈DNA解鏈，解離的DNA作為捕獲元素，進一步特異性結(jié)合辣根過氧化物酶（HRP），HRP催化四甲基二苯胺（TMB）底物顯色，測定A450nm與濃度的線性關(guān)系，確定OTA的檢出限。考察了DNA包被濃度、雜交溫度和封閉液等因素對檢測的影響。結(jié)果表明，在優(yōu)化的條件下，所建立的競爭取代酶聯(lián)適體分析法對OTA檢測有高靈敏度，檢測限0.88 μg/L，線性范圍1～100 μg/L在葡萄酒中添加時，加標回收率為92.03%～106.6%，相對標準偏差RSD（n=5）小于2.1%，此方法可用于葡萄酒中OTA的快速測定。

赭曲霉素A；競爭取代；酶聯(lián)適體分析；葡萄酒

赭曲霉素A（Ochratoxin A），簡稱OTA，是赭曲霉、炭黑曲霉和青霉菌等的次級代謝產(chǎn)物［1］，廣泛存在于谷類、咖啡和葡萄等農(nóng)作物及相關(guān)產(chǎn)品中［2］，可經(jīng)食物鏈進入人體，對人類健康造成巨大威脅。OTA毒性很大，可損傷人類的肝臟、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)［3］，并有致畸、致突變和致癌作用［4］。2006年，歐盟調(diào)查顯示，人類從葡萄酒中攝取的OTA含量占總量的13%，僅次于谷類［5］。至此，葡萄酒中OTA的檢測成為各國食品安全分析的新熱點。歐盟規(guī)定［6］葡萄酒中OTA的最大限量為2 μg/ L，我國尚未制定限量標準。目前葡萄酒中OTA檢測主要有高效液相法（HPLC）和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）［7-8］。HPLC法所用儀器昂貴、對樣品的預(yù)處理步驟復(fù)雜、檢測成本高、耗時長。ELISA彌補了HPLC的不足，可滿足大批量樣品和現(xiàn)場快速檢測等要求，但抗體易受外界條件的影響，檢測結(jié)果假陽性率高，只能作為儀器分析前的排查方法。

核酸適體（Aptamer）是高親和性和高特異性結(jié)合目標分子的單鏈寡核苷酸（DNA或RNA）［9］。與抗體相比，核酸適體容易合成和標記，具有良好的穩(wěn)定性，且成本低［10］。用核酸適體代替抗體發(fā)展ELISA，可以降低ELISA的成本，同時降低假陽性率。OTA的核酸適體已被成功篩選［11-12］，用核酸適體做識別元素的直接競爭和間接競爭酶聯(lián)分析法已被成功建立［12］，檢測原理和抗體做識別元素的檢測完全相同，且都是顯色淺者為陽性。關(guān)于具有新型檢測機理的酶聯(lián)適體分析方法研究甚少，因此作者旨在通過用雙鏈核酸適體作識別元素，建立顯色深者為陽性的競爭取代酶聯(lián)適體分析方法，檢測葡萄酒中的OTA。顯色深者為陽性，顯色結(jié)果更容易被裸眼觀察。該方法豐富了核酸適體免疫分析法的實際應(yīng)用，為保障酒類質(zhì)量安全提供了一種有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赭曲霉素A（OTA）、N-乙酰-L-苯丙氨酸（NAP）、華法林（Warfarin）、赭曲霉素B（OTB）和黃曲霉素B1（AFB1）：購自美國Sigma公司。生物素（biotin）標記的OTA核酸適體序列：5′-biotin-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-3′（DNA1）；和DNA1部分互補的異硫氰酸熒光素（FITC）標記的核酸序列：5′-FITC-CGC CAC CCA CAC CCG CAG-3′（DNA2）；和DNA2完全互補的核酸序列：5′-biotin-CTG CGG GTG TGG GTG GCG-3′（DNA3）；無標記的其它核酸序列（見表1）；均購自上海生工生物工程有限公司。所有核酸在使用前都用超純水配成100 μmol/L的儲備液。鏈霉親和素包衣的酶標板和四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物顯色液：購自美國ThermoScientific公司；Anti-FITC-HRP：購自美國Millipore公司；實驗用水為超純水，其它試劑均為分析純。

表1 實驗中用到的其它核酸序列Table 1Other DNA sequences used in the experiment

包被核酸適體用PBS緩沖液（0.1 mol/L，pH= 7.4）；洗滌用PBST緩沖液（0.1 mol/L，pH=7.4，含2 mmol/L MgCl2和質(zhì)量分數(shù)0.12%Tween 20）；結(jié)合緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl，120 mmol/L NaCl，20 mmol/L CaCl2，質(zhì)量分數(shù)0.02%Tween 20，pH= 8.5。2 g/L OTA及相關(guān)物質(zhì)的標準儲備液，用甲醇自行配制，4℃冰箱保存使用。葡萄酒樣品，購自西安超市，乙醇體積分數(shù)11%。

Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司制造；冷凍離心機、微量可調(diào)移液器：德國Eppendorf公司制造；SpectraMax Paradigm多功能酶標儀：美國Molecular Devices公司制造；搖床：德國IKA公司制造。

1.2 實驗方法

1.2.1 雙鏈核酸適體的優(yōu)化向OTA結(jié)合緩沖液中加入10 nmol/L核酸適體序列（DNA1）及它的互補序列（a或b或c），于37℃孵育20 min以確保完全雜交形成雙鏈DNA（dsDNA）；然后加入適量的核酸染料SYBR Green I（SG），室溫下孵育10 min，確保SG插入雙鏈DNA小溝區(qū)域；最后滴加100 μg/L的OTA，室溫下孵育30 min，測定和OTA反應(yīng)前后的溶液的熒光光譜，SG的最大激發(fā)波長為497 nm，收集500～650 nm的發(fā)射光譜，激發(fā)和發(fā)射狹縫均設(shè)為5 nm，計算熒光降低率。

1.2.2 核酸適體在酶標板上的包被首先向包被緩沖液PBS中加入DNA1和DNA2配成溶液（DNA2的濃度是DNA1的1.05倍），于37℃孵育20 min，DNA1和DNA2雜交形成部分互補的dsDNA。鏈霉親和素標記的酶標板用200 μL洗滌緩沖液洗滌3次，每次5 min。洗滌完畢，酶標板的每口加入100 μL dsDNA溶液，置于37℃搖床反應(yīng)1 h，通過生物素和鏈霉親和素的特異相互作用dsDNA包被到酶標板凹槽，移去反應(yīng)液，凹槽用洗滌緩沖液洗3次，保留待用。采用相同的方法將DNA3包被到在另一鏈霉親和素標記的酶標板的凹槽，DNA3的濃度為DNA1濃度的2倍。包被完畢，加質(zhì)量分數(shù)1%乳粉做封閉反應(yīng)，反應(yīng)時間1 h，反應(yīng)完畢洗滌3次，保留備用。

1.2.3 競爭取代酶聯(lián)適體分析的檢測步驟OTA標準溶液用結(jié)合緩沖液稀釋成系列濃度，分別加入到包被了dsDNA的酶標板的凹槽中，每槽100 μL，室溫下孵育反應(yīng)30 min，反應(yīng)完畢用移液器吸出反應(yīng)液，轉(zhuǎn)移至包被了DNA3的酶標板的凹槽中，于37℃搖床孵育反應(yīng)30 min，然后移去反應(yīng)液，用200 μL洗滌緩沖液洗滌3次，每次5 min。接著，每槽加100 μL按體積比1:5 000稀釋的Anti-FITC-HRP抗體，于37℃孵育30 min，移去反應(yīng)液，洗滌3次，最后加入TMB-H2O2底物顯色液，反應(yīng)30 min，藍色結(jié)果拍照。然后，用2 mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，藍色產(chǎn)物變黃，黃色產(chǎn)物用酶標儀測定其在450 nm處的吸光度值。根據(jù)測量得到的吸光度，繪制吸光度與OTA濃度的曲線。

1.2.4 方法特異性評價比較了與OTA結(jié)構(gòu)類似的兩種物質(zhì)：N-乙酰-L-苯丙氨酸（NAP）和華法林（Warfarin）的檢測結(jié)果。同時也考察了赭曲霉素B（OTB）和黃曲霉素B1（AFB1）對檢測的影響。以結(jié)合緩沖液作為陰性對照，用雙鏈核酸適體作為識別元素，用建立的競爭取代酶聯(lián)核酸適體法檢測。交叉反應(yīng)物的吸光度值為P，陰性孔吸光度值為N，計算P/N值。

1.2.5 實際樣品中OTA的添加回收實驗選擇超市中2種葡萄酒，取1g上述樣品，添加3個不同質(zhì)量濃度（1、5、10 μg/L）的OTA。用建立的競爭取代酶聯(lián)適體分析法和酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒（北京康源泰博生物科技有限公司提供）檢測，計算得出樣品中OTA的實際檢測質(zhì)量濃度，并按照以下公式（2）計算加標回收率

2 結(jié)果與分析

2.1 雙鏈核酸適體的優(yōu)化

競爭取代酶聯(lián)適體分析方法是由作者所在實驗室提出的，已成功用于ATP的檢測［13］，它的檢測原理是：核酸適體和靶標的特異性結(jié)合導(dǎo)致和核酸適體雜交的另一短鏈DNA自雙鏈上解離，解離的DNA通過互補雜交被另一酶標板上的DNA捕獲，進一步捕獲辣根過氧化物酶，從而催化TMB底物顯色，顏色深淺和靶標濃度成正比。競爭取代酶聯(lián)適體分析方法成功的關(guān)鍵在于核酸適體通過競爭反應(yīng)能發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換，從dsDNA轉(zhuǎn)變成靶標/aptamer復(fù)合物，即和核酸適體雜交的短鏈DNA在加入靶標時發(fā)生解鏈。

為了得到結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換效率最高的dsDNA，優(yōu)化了不同位置互補的dsDNA序列。表1中核酸序列a、b、c和核酸適體DNA1雜交后形成雙鏈DNA，分別稱為dsDNA1、dsDNA2和dsDNA3。圖1示出了不同dsDNA/SG體系與OTA反應(yīng)前后溶液的熒光光譜，在522 nm處有最大發(fā)射。熒光降低率數(shù)據(jù)顯示dsDNA1和OTA反應(yīng)后，熒光降低率值最大達58.1%，這說明dsDNA1和OTA發(fā)生反應(yīng)時結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換效率最高，因此選擇dsDNA1作為OTA的識別元素。

圖1 dsDNA/SG體系和OTA反應(yīng)前后的熒光光譜及熒光降低率Fig.1Fluorescence spectra and fluorescence decrease percentage of dsDNA/SG system before and after reaction with OTA

2.2 實驗條件的優(yōu)化

當(dāng)DNA2濃度為DNA1濃度的2倍時，對DNA1濃度進行了優(yōu)化，考察了25、50、75、100、125、150 nmol/L的DNA1包被時，檢測1 000 μg/L的OTA實驗結(jié)果（見圖2）：DNA1濃度為100 nmol/L時，A450（450 nm處的紫外吸光度）值最大，表明此時微孔板已被DNA1飽和。所以，實驗中DNA1包被濃度采用100 nmol/L。當(dāng)DNA1用量為100 nmol/L時，對DNA2包被濃度進行了優(yōu)化，考察了DNA2為100、105、110、120、130 nmol/L時，檢測1 μg/L OTA的實驗結(jié)果，以相對吸光度值差值（A-A0）為考察對像（見圖3）：DNA2濃度為105 nmol/L時，（A-A0）最大，檢測效果最理想。所以，實驗中DNA2包被濃度采用105 nmol/L。當(dāng)DNA1和DNA2用量一定時，對雜交溫度進行優(yōu)化，考察了25、37℃和45℃下雜交對檢測結(jié)果的影響，結(jié)果表明37℃時雜交效率最高，檢測結(jié)果最理想。洗滌緩沖液用文獻［13］報道的優(yōu)化的體系。

圖2 不同濃度DNA1包被酶標板對吸光度值的影響Fig.2Influences of DNA1 concentration coating onto micro plate wells on absorbance change

圖3 不同濃度DNA2包被酶標板對相對吸光度值的影響Fig.3Influences of DNA2 concentration coating onto micro plate wells on the relative absorbance value

封閉液的選擇：非特異性吸附引起的背景顏色較深，同時由于檢測限的定義與空白值的大小緊密相關(guān)，因此試圖通過封閉液的優(yōu)化來降低空白值。實驗中考察了核酸適體在最優(yōu)包被量的條件下，BSA、明膠、乳粉、酪蛋白質(zhì)等封閉液對空白值的影響，實驗結(jié)果表明（見圖4）：質(zhì)量分數(shù)1%乳粉做封閉液時，空白檢測值最?。ˋ450=0.154），因此選擇質(zhì)量分數(shù)1%乳粉作為封閉液。

圖4 封閉液對空白測定值的影響Fig.4Influences of blocking solution on determination of blank value

2.3 檢測結(jié)果及標準曲線的繪制

在優(yōu)化的實驗條件下，考察了此顯色體系對梯度稀釋的OTA的響應(yīng)。隨著OTA質(zhì)量濃度的增加，溶液顏色逐漸加深（見圖5（a），用裸眼觀察時，藍色產(chǎn)物比黃色產(chǎn)物更顯眼，所以圖5列出的是藍色顯色結(jié)果），450 nm處的紫外吸收值逐漸增大（見圖5（b），藍色產(chǎn)物加酸后，反應(yīng)被終止，藍色產(chǎn)物變成黃色，在450 nm處有最大吸收）。OTA與核酸適體序列發(fā)生特異性結(jié)合，導(dǎo)致越來越多的dsDNA分解成單鏈，隨著OTA質(zhì)量濃度的增加，解離并被另一DNA捕獲的FITC-DNA越來越多，從而使溶液顏色加深，吸光度值增大。在1～100 μg/L范圍內(nèi)，450 nm紫外吸收變化值，即相對吸光度值差值（A-A0）與OTA質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，見圖5（c），標準曲線方程為

相關(guān)系數(shù)R2=0.995。檢出限（LOD）定義為空白加3倍標準偏差對應(yīng)的OTA質(zhì)量濃度，依據(jù)定義計算得該方法的LOD值為0.88 μg/L（空白值的標準偏差為0.044）。該競爭取代酶聯(lián)適體分析法的靈敏度低于歐盟規(guī)定的限量標準，即能滿足歐盟的檢測要求。

圖5 TMB底物顯色體系對不同濃度OTA的顏色響應(yīng)、吸光度響應(yīng)及校正曲線（n=5）Fig.5Photograph of color，response of absorbance change at 450 nm and calibration curve（n=5）of TMB substrate system upon analyzing different concentrations of OTA

2.4 方法的特異性

選擇與OTA結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)N-乙酰-L-苯丙氨酸和華法林及赭曲霉素B和黃曲霉素B1作交叉反應(yīng)實驗，結(jié)合緩沖溶液作為陰性對照，用建立的競爭取代酶聯(lián)適體分析法測定10、5、1 μg/L的OTA，結(jié)果見表2。在交叉反應(yīng)物質(zhì)量濃度高達10 μg/L時，P/N值仍然均小于2，即無交叉反應(yīng)發(fā)生，說明所建立的檢測方法特異性良好。

表2 交叉反應(yīng)的實驗結(jié)果Table 2Experimental results of cross reaction

2.5 樣品的測定及添加回收實驗

準備兩份葡萄酒樣品，用作者建立的方法（ELAA）和購買的ELISA試劑盒同時測定，確定OTA的本底值，實驗結(jié)果見表3，兩種檢測方法的檢測結(jié)果一致，表明該方法能應(yīng)用于實際樣品葡萄酒中OTA檢測，準確性良好。

在兩份葡萄酒樣品中分別添加不同質(zhì)量濃度的OTA標準品，在實驗選定最佳條件下，進行OTA標準物質(zhì)的加標回收實驗，以驗證該方法應(yīng)用于實際樣品檢測的準確度，同時采用ELISA方法進行對照實驗。結(jié)果（表3）顯示：ELAA法葡萄酒樣品中標準OTA回收率為92.03%～106.6%，添加回收的相對標準偏差均低于2.01%；且檢測結(jié)果與ELISA方法的一致。進一步說明作者所建立的方法能夠用于實際樣品葡萄酒中OTA的有效檢測。

表3 回收率實驗（n=5）Table 3Experiment results of recovery（n=5）

3 結(jié)語

以dsDNA作為識別核酸適體，建立了檢測OTA的競爭取代酶聯(lián)核酸適體分析方法。在優(yōu)化的實驗條件下，在1～100 μg/L范圍內(nèi)，相對吸光度值差值（A-A0）與OTA質(zhì)量濃度呈良好線性關(guān)系，檢測限為0.88 μg/L。在實際樣品葡萄酒中添加適量的OTA后，添加回收率在92.03%～106.6%之間，相對標準偏差低于2.01%，該方法能用于葡萄酒中OTA含量的檢測，且方法簡單，結(jié)果準確，無需樣品前處理，檢測時間短，可滿足大批量樣品和現(xiàn)場快速檢測等的要求。

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Enzyme-Linked Aptamer Assay for Detection of Ochratoxin A in Wine

ZHAO Qiuling1，SHI Suqing2
（1.College of Mining Industry Technology，Liaoning Technical University，Huludao 125105，China；2.College of Chemistry&Materials Science，Northwest University，Xi’an 710069，China）

ompetitive enzyme-linked aptamer assay for Ochratoxin A（OTA）detection in wine was investigated in this study.The binding of aptamer to the target OTA resulted in the dissociation of the DNA short chain from the aptamer，which was further captured by horseradish peroxidase（HRP）.HRP catalyzed 3，3'，5，5'.-Tetramethylbenzidine（TMB）substrate and finally leaded to a characteristic change that was detectable by the absorption of ultraviolet at 450 nm.The detection limit of OTA was determined by the linear relationship between OTA concentration and the absorbance.The factors influenced the effect of detection were investigated，including DNA concentration，temperature of hybridization，and blocking buffer solution.This work described the high performance of the competitive enzyme-linked aptamer assay（ELAA）for the determination of OTA.Under the optimal condition，the limit of detection attained was 0.88 μg/L and the linearity was in the range 1 to 100 μg/L.For the OTA detection in wine，the recovery rate was between 92.03%and 106.6%，and the relative standard deviation（RSD，n=5）was within 2.1%.This study validates the competitive ELAA is a useful tool for a rapid detection of OTA in wine.

ochratoxin A，competitive displacement，enzyme-linked aptamer assay，wine

O657.1

A

1673—1689（2015）04—0396—06

2014-11-17

國家自然科學(xué)基金項目（21004047）；陜西省青年科技新星人才項目（2014KJXX-62）。

趙秋伶（1979-），女，遼寧北鎮(zhèn)人，理學(xué)博士，講師，主要從事生物化學(xué)與食品安全研究。E-mail:flyzhql@iccas.ac.cn