駱駝瘤胃乳酸菌對吡啶的降解研究

鄭李娟，安登第，費(fèi)瑩瑩，唐琴，曾獻(xiàn)春

（新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊，830054）

駱駝瘤胃乳酸菌對吡啶的降解研究

鄭李娟，安登第，費(fèi)瑩瑩，唐琴，曾獻(xiàn)春*

（新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊，830054）

將來源于駱駝瘤胃中的8株乳酸菌接種到以吡啶（300 μg/mL）為唯一碳源、氮源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，通過紫外分光光度計(jì)定期檢測乳酸菌的的吸光度值（600 nm），了解其生長情況；利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）動(dòng)態(tài)檢測的乳酸菌降解吡啶的殘留量，確定駱駝瘤胃中的乳酸菌對吡啶的降解能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：8株乳酸菌對吡啶都具有較強(qiáng)的降解能力，其中2株乳酸菌（GU366027、GU366021）培養(yǎng)84 h后，可以將吡啶完全降解；3株菌（GU366034、GU366019、GU366030）96 h后可以100%利用吡啶；3株（GU366037、GU366038、GU366028）108h能夠?qū)⑴囵B(yǎng)基中的吡啶完全轉(zhuǎn)化。研究提示駱駝瘤胃中的乳酸菌具有高效降解吡啶的作用。

駱駝瘤胃；乳酸菌；吡啶；降解

吡啶是一個(gè)氮原子取代了苯上的一個(gè)碳原子而形成的雜環(huán)化合物［1］，又稱氮苯，無色或微黃色液體，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可溶于水，有毒性，對眼及上呼吸道有刺激作用，能麻醉中樞神經(jīng)系統(tǒng)，吡啶還具有潛在的致癌作用。由于其高水溶性導(dǎo)致它在污染環(huán)境中非常容易遷移，擴(kuò)大污染范圍，對人類健康帶來危害。因此在工業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生的吡啶需要第一時(shí)間進(jìn)行處理，避免污染環(huán)境，危害生物健康［2-4］。目前對吡啶降解最有效的方法是微生物降解，但降解微生物大都來源于被污染的土壤和污水中，這些微生物本身具有一定的不安全性，在污染治理中存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)。乳酸菌是指一群通過發(fā)酵糖類，產(chǎn)生大量乳酸的無芽孢的革蘭氏陽性細(xì)菌的總稱［5］。乳酸菌代謝產(chǎn)物中除了乳酸等有機(jī)酸外，還產(chǎn)生少量細(xì)菌素、過氧化氫、雙乙酞等抑菌性物質(zhì)，對致病菌具有較強(qiáng)的抑制作用［6］，其中相當(dāng)多的乳酸菌對人、畜的健康起著有益的作用。

駱駝（Camelus bactrianus）是新疆沙漠地帶特有的動(dòng)物種群，常年以食用駱駝刺、假木賊、狼毒等含有毒物質(zhì)的植物為生，而自身仍然能夠健康生長［7-9］。從駱駝瘤胃中分離純化獲得到8株乳酸菌，經(jīng)生理生化和分子生物學(xué)鑒定，其主要?dú)w屬為：乳酸桿菌屬（Lactobacillus sp.）。鑒于駱駝可以降解和消化有害物質(zhì)的特殊功能主要依賴于瘤胃中的乳酸菌，選擇有機(jī)污染物吡啶為唯一碳源、氮源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)來源于駱駝瘤胃的8株乳酸菌，通過紫外分光光度計(jì)檢測乳酸菌的的吸光度值和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）檢測8株乳酸菌降解吡啶的殘留量，繪制降解曲線和生長曲線。初步探討其降解效率，為進(jìn)一步將乳酸菌應(yīng)用于有機(jī)污染物的處理提供研究依據(jù)［10-12］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源新疆師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供8株乳酸菌，登錄號為GU366019，GU366021，GU366027，GU366028，GU366030，GU366034，GU366037，GU366038。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

1）無機(jī)鹽培養(yǎng)基磷酸氫二鈉4.26 g，磷酸二氫鉀2.65 g，二水氯化鈣0.02 g，七水硫酸鎂0.2 g，七水硫酸錳0.002 g，七水硫酸亞鐵0.01 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0，121℃滅菌20 min。

2）固體分離培養(yǎng)基上述無機(jī)鹽培養(yǎng)基加瓊脂粉，15～20 g/L。

3）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2，121℃滅菌20 min。

4）LB液體培養(yǎng)基蛋白胨10 g，酵母浸出粉5 g，氯化鈉10g，蒸餾水1000mL，pH7.0，121℃滅菌20min。

5）試劑吡啶標(biāo)準(zhǔn)品（Aladdin，色譜純）；二氯甲烷（色譜純）。

1.1.3 儀器設(shè)備紫外可見分光光度計(jì)：UV-2800H，尤尼柯儀器有限公司產(chǎn)品；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent 7890A-5975C，Agilent公司產(chǎn)品。

1.1.4 降解吡啶微生物降解率檢測將來源于新疆師范大學(xué)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的8株乳酸菌接種到含以300 μg/mL吡啶為唯一碳源、氮源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，選用加吡啶不接種菌株的培養(yǎng)基作為空白對照。每4 h檢測菌的濃度，了解菌株在以吡啶為唯一碳源、氮源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的生長情況，并繪制生長曲線［13］；利用GC-MS每12 h檢測培養(yǎng)基中吡啶的殘留量，監(jiān)測降解菌株對吡啶的降解情況，繪制降解曲線［14-15］。

1.1.5 吡啶的萃取取5 mL菌液，加入5 mL二氯甲烷［16］，振蕩搖勻后，用超聲波超聲混勻，靜置過夜，收集下層二氯甲烷萃取液。

1.1.6 色譜條件色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 μm× 0.25 mm）；載氣：氦氣（99.999%）；流量：1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250℃；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣；分流比：50：1；程序升溫：初始溫度40℃，保持0.5 min，再以20℃/min的速度升溫到110℃。后運(yùn)行240℃，保持1 min。

1.1.7 質(zhì)譜條件接口溫度：280℃，離子源溫度：230℃，四級桿：150℃，電子轟擊能量：70 eV；溶劑延遲：2.1 min；掃描方式：全掃描模式，掃描范圍為20～550。質(zhì)譜庫：NIST2011。

1.1.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定配置吡啶質(zhì)量濃度為400 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用二氯甲烷將標(biāo)準(zhǔn)儲配液稀釋成濃度為25、50、100、200、400 μg/mL5個(gè)不同質(zhì)量濃度，分別進(jìn)樣后，以定量離子（m/z，79.1）的峰面積為縱坐標(biāo)，其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，求出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，以此計(jì)算被測樣品中吡啶的殘留量。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

已經(jīng)得到的菌種活化（即將斜面的休眠菌種使用涂布法接種至牛肉膏培養(yǎng)基平板進(jìn)行活化）。將活化的菌體接入100 mL的LB培養(yǎng)基（加入200 μg/mL吡啶，目的是為了防止雜菌生長）進(jìn)行菌體繁殖，搖床37℃，180 r/min條件下培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)的菌液在4 000 r/min，5 min條件下離心，收集菌體，用不含吡啶的無機(jī)鹽培養(yǎng)基洗滌3次，棄上清，收集菌體，加入無菌無機(jī)鹽培養(yǎng)基制成乳酸菌的的吸光度值（600 nm）為2的菌懸液。將菌懸液以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接種到以吡啶為唯一碳源氮源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中（搖床37℃，180 r/min條件下培養(yǎng)），每個(gè)菌株做3個(gè)重復(fù)。每隔4 h取樣測乳酸菌的的吸光度值（600 nm）及吡啶殘留量。萃取參照1.1.5進(jìn)行萃取，將萃取的菌液取1 μL二氯甲烷萃取液注入GC-MS，測定吡啶殘留量，了解菌株對吡啶的降解能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取溶劑選擇

由于吡啶是添加在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，所以在選萃取試劑時(shí)首先要考慮①萃取溶劑不能溶于水，②由于有機(jī)試劑易揮發(fā)，且在超聲萃取后需靜置過夜，所以選取的有機(jī)試劑密度必須大于水，以保證實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。二氯甲烷密度大，且不溶于水，萃取過程簡便快速，一次萃取就可以滿足回收率的要求；吡啶在二氯甲烷中響應(yīng)值較大，靈敏度較高［16］。而其他的有機(jī)試劑（如甲醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷等）不滿足上述條件，且在氣象色譜圖中與吡啶的目標(biāo)峰不易分開，所以選擇二氯甲烷作為萃取試劑。

2.2 待測物吡啶的定性

色譜法：采用保留時(shí)間對照法，比較標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品色譜圖中的相對保留時(shí)間。吡啶的出峰時(shí)間為：2.629 min，結(jié)果見圖1。

圖1 吡啶標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜Fig.1Chromatograms of pyridine standard sample

質(zhì)譜法：采用全掃描方式，排除有雜峰干擾的可能性，在質(zhì)量范圍為20～550之間進(jìn)行定性，吡啶的定型離子（m/z）為79.1、52.1、26.1，結(jié)果見圖2。

圖2 吡啶標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)譜圖Fig.2Mass spectra of pyridine standard sample

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制定

參照1.1.8的方法制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，以面積為縱軸，質(zhì)量濃度為橫軸，求出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，曲線方程：y=36 293x+13 954，結(jié)果見圖3。

圖3 吡啶的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3Standard curve of pyridine

2.4 測定方法回收率

采用標(biāo)樣加入法測定方法的回收率，即將300 μg/mL吡啶標(biāo)品加入到每個(gè)菌株的對照（只添加300 μg/mL吡啶的無機(jī)鹽培養(yǎng)基）中，用1.1.5的方法進(jìn)行萃取，將吡啶標(biāo)品測定量與吡啶標(biāo)品加入量的比值作為回收率，結(jié)果見表1回收率在76.63%～86.66%。

表1 吡啶的回收率Table 1Recovery rate of pyridine

菌種萃取量/（μg/mL）標(biāo)量/（μg/mL）回收率/%GU366034 GU366037 GU366038 245.19 229.90 239.58 300 300 300 81.73 76.63 79.67

2.5 降解吡啶菌株降解能力

得到菌株的降解率，通過GC-MS測定吡啶的殘留量，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算吡啶的降解率（每隔12 h測定）及生長曲線（每4 h進(jìn)行的測定），見圖4～11。

圖4 GU366021的生長曲線和吡啶降解率曲線Fig.4Growth curve and pyridine degradation curve of strain GU366021

圖5 GU366027的生長曲線和吡啶降解率曲線Fig.5Growth curve and pyridine degradation curve of strain GU366027

圖6 GU366019的生長曲線和吡啶降解率曲線Fig.6Growth curve and pyridine degradation curve of strain GU366019

圖7 GU366030的生長曲線和吡啶降解率曲線Fig.7Growth curve and pyridine degradation curve of strain GU366030

圖8 GU366034的生長曲線和吡啶降解率曲線Fig.8Growth curve and pyridine degradation curve of strain GU366034

圖9 GU366028的生長曲線和吡啶降解率曲線Fig.9Growth curve and pyridine degradation curve of strain GU366028

由圖4～11可知，8株乳酸菌降解菌株在添加吡啶（300 μg/mL）的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長較緩慢，遲緩期72 h左右。當(dāng)菌株生長到達(dá)對數(shù)期時(shí)，8株菌株對吡啶的利用速度加快，顯示較強(qiáng)的降解能力，其中2株（GU366027、GU366021）在84 h，3株（GU366034，GU366019、GU366030）在96 h，3株（GU366037，GU366038、GU366028）在108 h將吡啶完全降解，培養(yǎng)基中吡啶的殘留量為零，降解率為100%。

圖10 GU366037的生長曲線和吡啶降解率曲線Fig.10Growth curve and pyridine degradation curve of strain GU366037

圖11 GU366038的生長曲線和吡啶降解率曲線Fig.11Growth curve and pyridine degradation curve of strain GU366038

實(shí)驗(yàn)中乳酸菌最初在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長比較緩慢，遲緩期較長，在這段時(shí)間里對吡啶的降解能力也不高，可能是吡啶作為有害物質(zhì)，在菌株的接種初期對菌株產(chǎn)生了毒害作用，部分菌種死亡。進(jìn)入遲緩期的菌株的調(diào)節(jié)機(jī)制為應(yīng)對惡劣環(huán)境做出改變，利用吡啶作為碳、氮源供給自身生長，在經(jīng)過較長一段遲緩期后，能夠較好應(yīng)用吡啶作為碳、氮源供給生長，當(dāng)菌株生長到達(dá)對數(shù)期時(shí)，8株菌株對吡啶的利用速度加快，顯示較強(qiáng)的降解能力。

3 討論

目前吡啶降解菌主要來源于被污染的環(huán)境，而對動(dòng)物消化道微生物對吡啶的降解研究較少。Lynn Vanhaecke等對來自6位正常成人腸道中的微生物以吡啶為碳源進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)吡啶可以被人體腸道中微生物降解和轉(zhuǎn)化，不同腸道樣品72 h降解率為47～95%，使吡啶失去對機(jī)體的致突變作用［18］，該研究提示動(dòng)物消化道微生物在機(jī)體內(nèi)對吡啶轉(zhuǎn)化和降解起著重要作用。目前對乳酸菌降解有毒有害物質(zhì)的研究主要集中在亞硝酸鹽、黃曲霉毒素和膽固醇降解等方面［19-20］。

作者研究的乳酸菌菌株來源于駱駝瘤胃，有別于乳制品發(fā)酵、蔬菜發(fā)酵和自然環(huán)境中的乳酸菌，具有特殊的生理功能。一方面在駱駝體內(nèi)發(fā)揮著降解駱駝常食用植物的毒素，保障食用駱駝蓬、假木賊、狼毒等有毒植物而不會(huì)中毒［11］；另一方面在駱駝瘤胃特殊環(huán)境中的長期適應(yīng)，具有了降解有害物質(zhì)的能力，并可以嘗試應(yīng)用于其它有害物質(zhì)的降解研究。作者對駱駝瘤胃中的8株乳酸菌降解吡啶的能力開展研究，證實(shí)駱駝瘤胃乳酸菌可以高效降解吡啶。希望駱駝瘤胃乳酸菌可以有效應(yīng)用于環(huán)境污染物的降解和處理，為環(huán)境污染的生物處理提供新的微生物資源，擴(kuò)大乳酸菌的應(yīng)用范圍；也為動(dòng)物源乳酸菌降解有害物質(zhì)的研究提供研究方法和思路。后期研究將進(jìn)一步探討降解乳酸菌的最佳降解條件和降解機(jī)制，希望能夠?qū)碜择橊勏澜到膺拎さ娜樗峋行У貞?yīng)用于環(huán)境污染的治理。

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Study on the Biodegradation of Pyridine by Lactobacillus Reuteri from Camel Rumen Extracts

ZHENG Lijuan，AN Dengdi，F(xiàn)EI Yingying，TANG qin，ZENG Xianchun*
（College of Life Science/Special Environment Species Protection and Regulation Biology Laboratory of Xinjiang，Xinjiang Normal University，Urumqi 830054，China）

8 lactobacillus reuteri were isolated from camel rumen and then cultured in mineral saults medium using pyridine（300 μg/mL）as the sole carbon source and nitrogen source.The absorbance at 600 nm was periodically measured by UV spectrophotometer to check the growth of Lactobacillus.The degradation of pyridin by lactobacillus reuteri was dynamically detected using Gas Chromatography-Mass Spectrometry（GC-MS）and the residual amount after degradation was calculated.According to the results，all the lactobacillus could effectively degraded pyridine，among which GU366027 and GU366021 can completely degraded pyridine when cultured for 84 h，while GU366034，GU366019 and U366030 needed 96h and others（GU366037，GU366038，GU366028）for 108 h.

camel rumen，lactobacillus reuteri，pyridine，biodegradation

Q 939.9

A

1673—1689（2015）04—0361—06

2014-08-13

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31160028）；新疆自治區(qū)高?？蒲杏?jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（XJEDU2010I44）；新疆師范大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（20131211）；

*通訊作者：曾獻(xiàn)春（1971-），女，江蘇徐州人，教授，主要從事應(yīng)用微生物學(xué)研究。E-mail:zengxc2004@163.com