中國青海省Tahyna病毒的分離鑒定及其人畜感染

李文娟，付士紅，姜雙應，王志玉，梁國棟

2.中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所病毒性腦炎室，傳染病預防與控制國家重點實驗室，北京 102206；

3.青海省疾病預防控制中心，西寧 810007；

4.山東大學 公共衛(wèi)生學院，濟南 250012

Tahyna病毒（Tahyna virus，TAHV）屬于布尼亞病毒科（Bunyaviridae）正布尼亞病毒屬（Orthobunyavirus）加利福尼亞腦炎病毒血清組（California serogroup），是歐洲大陸廣泛流行蚊蟲傳播蟲媒病毒[1]。人類感染TAHV后可出現(xiàn)發(fā)熱、胃腸不適、肺炎甚至病毒性腦膜炎等疾病[2－3]。2006年夏季，呂志等從我國新疆喀什地區(qū)采集的蚊蟲標本中分離到TAHV（XJ0625），這是我國首次分離到該病毒[4]。2007年在青海省格爾木市采集的屑皮伊蚊（AdeseOchlerotatusdetritus）蚊蟲標本中分離到2株 TAHV（QH07029，QH07060）[5]，進一步研究證實青海省新分離TAHV是引起當?shù)匕l(fā)熱性疾病的新病原[6]，TAHV感染成為我國除乙腦、登革之外的第三種蚊蟲傳播病毒性疾病。本文結合本課題組在青海省開展的多年調(diào)查研究工作，就青海省分離的TAHV生物學特征、自然循環(huán)、流行病學、臨床致病特點等相關研究結果等進行系統(tǒng)綜述。

1 生物學特征

1.1 對細胞的致病性 TAHV對BHK－21和Vero細胞等哺乳動物能夠引起明顯的細胞病變效應，接種36～48h即可細胞融合，48h后細胞圓縮、脫落，病變進展較快；對蚊蟲細胞，C6／36細胞，接種后不引起細胞病變，接種6d后收獲上清液，上清液再次接種BHK細胞2d后引起細胞病變，說明雖然TAHV不引起C6／36細胞病變，但是可以在該細胞內(nèi)增殖，這與TAHV新疆分離株的細胞致病性是一致的[5，7]。

1.2 基因組特征 TAHV為單股負鏈RNA病毒，分為L、M、S三個節(jié)段。應用TAHV S節(jié)段引物進行RT－PCR擴增，選擇其所在的布尼亞病毒屬其他毒株做參考，進行序列比對。結果顯示，青海省分離的2株TAHV（QH07029，QH07060）高度同源（99.9%）；它們與TAHV 原型株Bardos 92病毒株氨基酸同源性分別為90.0%和90.1%[5]。系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，TAHV青海分離株（QH07029，QH07060）與Bardors 92株位于同一進化分支，與中國新疆分離株的進化距離則較遠（見圖1）。

眾所周知，歐洲國家與中國新疆南疆地區(qū)和青海省格爾木市之間相隔數(shù)千公里，存在沙漠和高山等地理位置上的阻隔，TAHV病毒分別在當?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境的長期進化形成了相對穩(wěn)定和獨立的進化。已有研究顯示，TAHV在歐洲長期廣泛流行，甚至成為當?shù)刂饕奈孟x傳播病毒性疾病，但是在亞洲一直未見該病毒分離和引起疾病的報道，我國自1990年代開始在新疆等地開展的蟲媒病毒調(diào)查也一直未發(fā)現(xiàn)TAHV，但是近年來在我國新疆、青海、內(nèi)蒙古采集的蚊蟲標本中連續(xù)分離到該病毒[4－5，8]，提示該TAHV為輸入性蟲媒病毒并在我國西北部地區(qū)廣泛存在，這一發(fā)現(xiàn)具有重要公共衛(wèi)生意義也為我國媒介傳染病的預防控制提出了新的課題。

圖1 基于布尼亞病毒屬S節(jié)段核苷酸序列構建的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic analysis of Orthobunyavirus based on S segment

2 自然循環(huán)

2.1 傳播媒介 作為蚊蟲傳播蟲媒病毒，TAHV在自然界一般是通過“病毒—蚊蟲—動物”途徑進行循環(huán)。據(jù)文獻報道，TAHV的傳播媒介包括4屬12種蚊蟲[9]，歐洲TAHV分離株約58%來自刺擾伊蚊，該蚊種被認為是歐洲TAHV最重要的傳播媒介[10]。青海省格爾木市位于在青藏高原，海拔高度達2 780米，6～8月為當?shù)赜昙?，蚊蟲密度高，由于當?shù)佧}堿灘眾多，優(yōu)勢蚊種為耐鹽的屑皮伊蚊。在青海省格爾木市分離的兩株TAHV均來自屑皮伊蚊標本，TAHV對該蚊種的現(xiàn)場感染率（infection rate，IR）為1.08[5]。此前未見有從該蚊種中分離到TAHV的報道，提示TAHV能夠在不同自然地理條件下利用不同的傳播媒介作為病毒繁殖的媒介。

2.2 宿主動物 研究顯示，兔、刺猬、黃鼠、貂、狐貍、睡鼠、乳豬等動物在實驗室條件下感染TAHV后，均可在體內(nèi)檢測到病毒血癥[9]。青海省是我國的重要牧區(qū)，牛、羊等家畜數(shù)量眾多，主要在水草豐富的草原或河灘上進行放牧。這些區(qū)域同時也適宜蚊蟲孳生，因此動物容易遭受蚊蟲叮咬而感染TAHV。我們對青海省格爾木市、西寧市和民和縣的主要家養(yǎng)動物進行血清學調(diào)查，且在格爾木市擴大了動物種類。通過間接免疫熒光檢測（indirect immunofluorescence assay，IFA）和中和試驗發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)陽性血清來自格爾木市；格爾木市以野兔、牛、綿羊抗體陽性率較高，其中IgG陽性率分別為38% （5／13）、15.5% （17／110）和 10.9% （12／110）；中和抗體陽性率分別為23%（3／13）、12.7%（14／110）和9.1%（10／110）[5－6]，見表1。因此，可以認為當?shù)嘏?、羊、兔等動物在維持TAHV在自然界中的持續(xù)存在和循環(huán)，形成自然疫源地的過程中發(fā)揮重要作用。當?shù)啬撩窳晳T與家畜同住一處，也為TAHV在蚊蟲、儲存宿主、易感人群之間的循環(huán)提供了更為便利的條件。

3 流行病學

由于TAHV為我國新分離蟲媒病毒，其流行病學調(diào)查較少，主要集中在新疆和青海。新疆南部喀什地區(qū)發(fā)熱患者急性期血清中IgM和IgG抗體陽性率分別為5.3%和18.3%，提示當?shù)匕l(fā)熱人群存在TAHV的急性感染和既往感染[11]。為進一步明確TAHV在我國的流行情況，2007－2009年，在青海省健康人群和發(fā)熱人群開展TAHV血清流行病學調(diào)查。

3.1 健康人群感染狀況 2007～2008年，在青海省格爾木市，西寧市和民和縣共采集1 078份健康人血清，經(jīng)檢測TAHV IgG抗體總陽性率為1.8%（19／1078）；從地區(qū)分布看，格爾木市抗體陽性率為4.4%（16／366）；西寧市為0.6%（2／352）；民和縣為0.3%（1／360）[5]，見表2。格爾木市人群中較高的IgG抗體總陽性率，表明在當?shù)仄毡榇嬖赥AHV的既往感染或隱性感染。從年齡分布看，抗體陽性標本均來自30歲以下人群，其中以格爾木市5～9歲年齡組陽性率最高，為7.14%（5／70）。一般而言，在長期形成的自然疫源地，以大年齡組的感染幾率或抗體陽性率較高。格爾木市TAHV抗體陽性以小年齡組為主，提示TAHV在當?shù)卮嬖跁r間較短，推測TAHV可能為1990年代從國外傳入青海[12]。

表1 青海省動物TAHV抗體檢測陽性率Tab.1 Prevalence of antibody against TAHV in livestock in Qinghai

3.2 發(fā)熱病人感染狀況 2009年7～9月，在青海省格爾木市、西寧市和民和縣采集661例以發(fā)熱為主訴的門診病人血清標本。格爾木市發(fā)熱病人中TAHV IgM 抗體陽性率（5.24%，12／229）明顯高于西寧市（2.05%，5／195）和民和縣（2.11%，5／237）；其中格爾木市IgM抗體陽性率以10～19歲年齡組（12%，4／33）最高，這可能與青少年戶外活動較多，有更多機會受到蚊蟲叮咬而感染TAHV所致[5－6]。經(jīng)統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)青海省健康人與發(fā)熱病人TAHV中和抗體陽性率存在明顯的差異（χ2＝5.733，P＝0.014）（具體數(shù)據(jù)見表2）；表明青海省TAHV感染與發(fā)熱等疾病之間存在著一定聯(lián)系，提示TAHV可能是引起當?shù)厝巳合募景l(fā)熱性疾病的病原體。

表2 青海省健康人群和發(fā)熱病人TAHV中和抗體陽性率比較Tab.2 Comparison of prevalence of neutralizing antibody against TAHV between health residents and febrile patients in Qinghai

4 臨床癥狀

國外研究報道，TAHV感染人類后引起的疾病主要表現(xiàn)為感冒樣癥狀，患者一般為突然發(fā)熱，伴有頭痛、精神不振、結膜炎、咽炎、肌痛、惡心、胃腸道癥狀、食欲減退，偶有關節(jié)痛及頸強直等中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，國外稱為“Valtice fever”。疾病流行于夏秋季節(jié)；也有引起非典型性肺炎和腦膜腦炎的報道[9，13]。雖然我國人群中已檢測到TAHV抗體，但一直缺乏TAHV致病的直接證據(jù)。

為明確我國是否存在TAHV感染病例，2009年在青海省TAHV分離地格爾木市開展病例搜索和隨訪調(diào)查研究。經(jīng)實驗室檢測，共獲得5例TAHV現(xiàn)癥感染的實驗室確診病例，其中4例檢測到急性期血清TAHV IgM抗體陽性和雙份血清中和抗體四倍以上增高，2例急性血清中檢測到TAHV IgM抗體陽性和TAHV核酸陽性，證實我國存在TAHV感染引起的相應疾病[6]。

TAHV感染病例初診時均具有相似的臨床癥狀：發(fā)熱、咽痛、食欲不振、關節(jié)痛、頭痛、全身酸痛乏力等。隨訪調(diào)查結果顯示，經(jīng)過抗病毒和對癥治療，所有病例的癥狀在2～5d均消失（部分沒有藥物治療的病例的癥狀也自動消失（具體情況見表3）。所有病例預后均較好，經(jīng)過3個月隨訪，未觀察到癥狀加重和（或）死亡病例等。這是我國首次發(fā)現(xiàn)TAHV現(xiàn)癥感染病例，其感染癥狀輕微，預后良好， 多為自愈性疾病。

表3 2009年青海省格爾木市TAHV感染病例的臨床癥狀及實驗室檢測Tab.3 Clinical features and laboratory tests of TAHV infection cases in Geermu，Qinghai，2009

5 展 望

通過2007－2009年在青海省開展系統(tǒng)研究，在格爾木市分離到TAHV并證實TAHV是引起當?shù)匕l(fā)熱性疾病的新病原體，TAHV感染成為我國繼乙腦、登革之外的第三種蚊蟲傳播病毒性疾病，這一發(fā)現(xiàn)為我國蚊蟲傳播病毒性疾病的預防控制提出新的課題，也為我國甚至世界范圍內(nèi)高原地區(qū)蚊蟲傳播病毒性疾病的預防與控制以及相關策略的調(diào)整提供重要基礎數(shù)據(jù)。

TAHV感染作為一種蚊蟲傳播病毒性疾病，具有自然疫源的屬性，疾病的播散具有一定的地域性。目前隨著全球氣候的變暖，國際經(jīng)濟領域及地區(qū)間交流合作的增多，使得蚊蟲傳播疾病的廣泛播散成為可能。新疆、青海和內(nèi)蒙古3省對病毒的分離，提示TAHV在我國可能已經(jīng)廣泛存在；我國的TAHV雖然分離自不同的蚊種，但均來自當?shù)氐膬?yōu)勢蚊種，提示在當?shù)鼐哂锌焖俨ド⒌臐撛谕{。然而我國大部分省份已持續(xù)開展蟲媒病毒研究分離到多株蟲媒病毒，而TAHV僅在新疆、青海、內(nèi)蒙古3個西北省份分離到。為何我國的TAHV僅存在于西北地區(qū)，不同分離株之間存在怎樣的聯(lián)系仍是需要解決的問題。此外，加強我國其他地區(qū)TAHV的檢測與監(jiān)測，特別是在臨床發(fā)熱病例中發(fā)現(xiàn)該病毒感染的病例，闡明該病毒感染在我國人群中的發(fā)病規(guī)律和疾病負擔，并據(jù)此提出預防控制措施等是需要今后長期開展的研究課題。

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