聚酰胺樹脂純化銀杏總內(nèi)酯的工藝研究*

李雪峰 ，徐振秋 ，劉俊超 ，王 雪 ，劉莉莉 ，楊緒芳 ，蕭 偉 **江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，連云港 00；中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室，連云港 00

銀杏（Ginkgo biloba L.）為銀杏科銀杏屬植物，為落葉高大喬木，僅在我國幸存，被達爾文稱為“活化石”[1]。銀杏內(nèi)酯獨特的生理作用和治療價值已引起世界范圍醫(yī)療行業(yè)的極大興趣。國內(nèi)外學者已發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C、銀杏內(nèi)酯J， 均為血小板活化因子 （platelet activating factor，PAF）拮抗劑，白果內(nèi)酯可用于治療脫髓鞘腦脊髓和神經(jīng)疾病[2]。聚酰胺是一種價廉易得的化工原料，具有使用范圍廣、使用壽命長、分離效果好、實驗操作簡單等特點，廣泛用于天然產(chǎn)物中有機物和某些金屬元素的富集分離[3]。目前文獻報道的提取純化銀杏內(nèi)酯方法主要是采用有機溶劑多級萃取、結(jié)晶或反復(fù)柱色譜分離[4]，存在著工藝繁瑣和生產(chǎn)成本高等問題。本實驗采用聚酰胺樹脂對銀杏葉提取物中的銀杏總內(nèi)酯進行分離純化，該方法具有操作簡單，生產(chǎn)成本低，適合于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)等特點。

1 儀器與材料

Sorvall RC6 Plus高速離心機 （上海安亭科學儀器廠）；CL-2磁力加熱攪拌器 （鞏義市予華儀器有限責任公司）。

銀杏葉提取物（銀杏內(nèi)酯含量7.4%，徐州技源天然保健品公司）；聚酰胺樹脂（西安藍深特種樹脂有限公司）。白果內(nèi)酯，銀杏內(nèi)酯A、B、C對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號依次為1108656-200605、110862-201310、110863-201209、110864-200906）；甲醇為色譜純；氫氧化鈉、醋酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 聚酰胺樹脂預(yù)處理

聚酰胺樹脂用95%乙醇浸泡48 h，純化水洗至無醇味，再用1%NaOH浸泡24 h，濾掉堿液，純化水洗至中性，用4倍量10%醋酸浸泡24 h，純化水洗至中性并浸泡備用。

2.2 銀杏總內(nèi)酯含量測定方法[5]

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；柱溫：30℃；以甲醇-四氫呋喃-水（23∶10∶75）為流動相；流速：1.0 mL·min-1；蒸發(fā)光散射檢測器檢測。理論板數(shù)按白果內(nèi)酯峰計算應(yīng)不低于3000。

對照品溶液的制備：精密稱取白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、B、C對照品，加少量甲醇使溶解，制成每毫升含 1.6、1.0、0.6、0.8 mg的混合溶液，作為對照品溶液。

標準曲線的繪制：精密吸取混合對照品溶液1、2、4、6、8 mL，分別于 10 mL 量瓶中，流動相定容至刻度。取10 μL注入色譜儀中，測定峰面積，以峰面積對數(shù)為縱坐標與質(zhì)量濃度對數(shù)為橫坐標的回歸方程為：白果內(nèi)酯：Y=1.563X+1.773，r=0.9996；銀杏內(nèi)酯A：Y=1.5831X+1.733，r=0.9999；銀杏內(nèi)酯 B：Y=1.511X+1.639，r=0.9997； 銀杏內(nèi)酯 C：Y=1.5872X+1.7425，r=0.9995。結(jié)果表明，白果內(nèi)酯，銀杏內(nèi)酯A、B、C 分別在進樣量 1.6～12.8 μg、1.0～8.0 μg、0.6～4.8 μg、0.8～6.4 μg、0.6～4.8 μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。HPLC-ELSD色譜圖見圖1。

2.3 銀杏總內(nèi)酯的提取

取銀杏葉提取物，加水攪拌溶解、離心，減壓濃縮至密度1.05 g·mL-1，得銀杏總內(nèi)酯溶液，HPLC法測定銀杏總內(nèi)酯含量為18.0 mg·g-1，備用。

2.4 樹脂篩選[6]

2.4.1 吸附率考察準確稱取預(yù)處理好的30～60目與60～90目聚酰胺樹脂各20 g，分別加入銀杏總內(nèi)酯溶液40 g，室溫放置，每隔30 min攪拌吸附5 min，持續(xù)3 h，過濾，集濾液，HPLC法測定其中銀杏總內(nèi)酯含量，計算吸附率。結(jié)果見圖2。

吸附率=（初始液濃度-吸附后剩余溶液濃度）×100%/初始液濃度

2.4.2 解吸率考察將“2.4.1”項下吸附飽和的樹脂分別加入200 mL純化水，每隔30 min攪拌吸附5 min，持續(xù)3 h，過濾，集濾液。測定銀杏總內(nèi)酯含量，計算解吸率。結(jié)果見圖2。

圖2 不同樹脂對銀杏總內(nèi)酯的吸附作用

解吸率=洗脫液濃度/（初始液濃度-吸附后剩余溶液濃度）×100%

結(jié)果兩種樹脂的吸附與解吸無明顯差異，結(jié)合生產(chǎn)成本選用30～60目聚酰胺樹脂進行純化。

2.5 洗脫溶劑選擇

取處理好的30～60目聚酰胺樹脂20 g，取銀杏總內(nèi)酯溶液40 g上樣，平行5份進行樣品吸附后，分別用純化水、10%、20%、30%、50%乙醇溶液200 mL進行洗脫，收集洗脫液，測定銀杏總內(nèi)酯含量計算洗脫率，見表1。

表1 不同洗脫溶劑對銀杏總內(nèi)酯的洗脫率和含量的影響（n=4）

洗脫率%=洗脫液中銀杏總內(nèi)酯的總量（g）/上樣液中銀杏總內(nèi)酯的總量（g）×100%

結(jié)果顯示，10%、20%、30%、50%乙醇洗脫劑洗脫時雜質(zhì)較多，故選擇純化水作為洗脫溶劑。

2.6 徑高比考察

取處理好的30～60目聚酰胺樹脂3份，每份40g，分別裝于徑高比為 1∶4、1∶6、1∶8 的玻璃層析柱中。 分別注入銀杏總內(nèi)酯溶液，純化水洗脫，收集洗脫液，測定銀杏總內(nèi)酯含量，考察徑高比對吸附性能的影響，見圖3。

圖3 不同徑高比對樹脂吸附的影響

結(jié)果徑高比1∶4時洗脫液中雜質(zhì)含量較高，影響純度；徑高比1∶6與1∶8時對樹脂的吸附洗脫無明顯差異，結(jié)合生產(chǎn)實際選1∶6徑高比進行分離與純化。

2.7 上樣藥液濃度考察

流速不變，選擇最大濃度18.0 mg·g-1的銀杏總內(nèi)酯溶液，再適當降低其濃度，每一柱體積（V=127 cm3）采集樣品一次，測定樣品中銀杏總內(nèi)酯含量，見圖4-A。結(jié)果表明，上樣藥液濃度對樹脂吸附洗脫無明顯差異，選擇上樣藥液濃度18.0 mg·g-1。

2.8 上樣量考察

取銀杏總內(nèi)酯溶液，注入處理好的聚酰胺樹脂柱（V=127 cm3），每上樣10 g收集1次，收集 7份，測定洗脫液中銀杏總內(nèi)酯含量，由圖4-B可見上樣量30 g以后開始泄漏。柱體積127 cm3時，上樣量不高于30 g。

2.9 上樣吸附流速考察

將銀杏總內(nèi)酯溶液20 g分別以1.0、2.0、4.0 mL·min-1流速通過樹脂柱，分段收集洗脫液，每管收集一個柱體積，測定流出液中銀杏總內(nèi)酯的含量，見圖4-C。

結(jié)果表明，吸附流速對內(nèi)酯洗脫無影響，將上樣吸附流速控制在2.0～4.0 mL·min-1。

2.10 洗脫工藝研究

2.10.1 洗脫流速考察考察不同流速1.0、2.0、4.0 mL·min-1對洗脫率的影響。由表2可見洗脫劑流速對樹脂洗脫無明顯差異，選擇洗脫劑流速為2.0～4.0 mL·min-1。

表2 洗脫流速對洗脫率的影響

圖4 不同狀態(tài)的銀杏總內(nèi)酯吸附曲線

2.10.2 水洗脫分布考察取銀杏總內(nèi)酯溶液1 kg（含總內(nèi)酯18.0 g）注入處理好的聚酰胺柱（V=4710 cm3），純化水洗脫，分段收集洗脫液，測定銀杏總內(nèi)酯含量，結(jié)果見表3。

表4 銀杏總內(nèi)酯的分離與純化工藝研究工藝驗證

表3 水洗脫分布工藝考察

結(jié)果流份1、5的洗脫液中總內(nèi)酯含量較低，雜質(zhì)較多，該流份不作為收集流份。

3 工藝驗證

根據(jù)以上實驗結(jié)果擬定最佳工藝：選擇30～60目聚酰胺樹脂，最大上樣提取物質(zhì)量與柱體積比1∶50，洗脫溶劑為純化水，徑高比1∶6，洗脫流速2.0～4.0mL·min-1，洗脫量2.5倍柱體積，進行3批放大工藝驗證實驗。洗脫液分別濃縮，減壓干燥，稱重，計算總固形物收率并測定其銀杏總內(nèi)酯含量。收率與洗脫率均比較穩(wěn)定，說明該分離與純化工藝可行。結(jié)果見表4。

收率%=純化后得到的銀杏總內(nèi)酯原料重量（g）/銀杏葉提取物投入重量（g）×100%

4 討 論

由于聚酰胺對銀杏總內(nèi)酯吸附較弱，對黃酮類、鞣質(zhì)等吸附較強，故利用聚酰胺樹脂的吸附特性完成銀杏總內(nèi)酯的純化。本文采用水溶解銀杏葉提取物，選擇聚酰胺進行吸附，純化水除雜、洗脫，具有成本低、易操作、環(huán)保等特點，經(jīng)3批實驗驗證其純化工藝可行。

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[5]喬 蓉，鐘世安，鄧瀟君，等.聚酰胺樹脂純化荷葉堿的工藝研究[J]. 化學與生物工程，2008，25（5）：35-8.

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