高內(nèi)涵篩選結(jié)合活細胞實時成像技術(shù)分析谷氨酸誘導(dǎo)的小鼠神經(jīng)瘤母細胞N2a凋亡

喬 可 崔士超 胡捷先 陳獻華

（1復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部／衛(wèi)生部重點實驗室，2醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)國家重點實驗室 上海 200032）

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一種重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在突觸可塑性和介導(dǎo)突觸興奮性活動等方面發(fā)揮著重要的作用，對腦內(nèi)神經(jīng)元生長發(fā)育、分化、遷移、成熟、修復(fù)等具有重要的影響［1］。但在病理情況下，過多谷氨酸積聚可導(dǎo)致谷氨酸受體的過度激活引起鈣超載，從而激活神經(jīng)毒性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最后導(dǎo)致細胞凋亡和壞死。目前認(rèn)為谷氨酸興奮毒性與多種神經(jīng)元退行性疾病的神經(jīng)元丟失有關(guān)，包括阿爾茨海默病、帕金森綜合征、亨廷頓氏疾病、多發(fā)性硬化癥等［2－3］。研究證實，谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡模型具有良好的可重復(fù)性，可作為研究神經(jīng)元凋亡的可靠實驗?zāi)Ｐ停?－5］。因此，建立和評價谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞損傷模型，對研究神經(jīng)損傷和退行性疾病有重要意義。

高內(nèi)涵篩選（high－content screening，HCS）分析系統(tǒng)是利用顯微成像及圖像分析技術(shù)，在細胞結(jié)構(gòu)和功能完整的條件下，實時快速檢測樣品多維立體的生物效應(yīng)信息，在單個細胞／亞細胞水平獲取樣品生物學(xué)變化的多元化數(shù)據(jù)，包括單細胞圖像和各項指標(biāo)、細胞群體的統(tǒng)計分析結(jié)果、細胞數(shù)量和形態(tài)改變、亞細胞結(jié)構(gòu)變化、熒光信號隨時間和空間的變化等［6－7］。該分析系統(tǒng)不僅能夠像傳統(tǒng)流式細胞儀那樣進行群體分析，而且還可以對群體分析中具有特定數(shù)值特征的細胞進行形態(tài)觀察和數(shù)值檢測。神經(jīng)瘤母細胞N2a是小鼠神經(jīng)外胚層來源的細胞，因其易于轉(zhuǎn)染并大量表達微管蛋白等特點，在神經(jīng)細胞分化、軸突生長及信號通路領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用［8］。

本實驗利用HCS技術(shù)，分析不同濃度谷氨酸誘導(dǎo)的N2a細胞凋亡比例；并結(jié)合活細胞實時成像技術(shù)，跟蹤谷氨酸誘導(dǎo)不同時間下的N2a凋亡的形態(tài)學(xué)變化特征以及N2a凋亡過程的各項指標(biāo)，包括凋亡過程中細胞核的凝縮過程以及細胞核碎片化的過程。

材料和方法

儀器和試劑 HCS分析系統(tǒng)（Perkin Elmer Operetta）；Annexin V－FITC／PI試劑盒（BD），Hoechst 33342（Sigma），NucRed Live 647（Life Technologies）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Fisher Scientific）。

細胞培養(yǎng) N2a細胞在含10%胎牛血清（FBS）的MEM培養(yǎng)基（Gibco）中通氣培養(yǎng)（37℃、5%CO2）。每3天以0．05%胰酶消化，按1∶5的比例傳代。

谷氨酸處理細胞 將細胞接種于96孔板，每孔含100μL培養(yǎng)液，培養(yǎng)36 h后每孔加入不同濃度谷氨酸（250、500、750、1 000μg／mL）處理24 h，對照孔不加谷氨酸。

細胞熒光標(biāo)記 谷氨酸處理24 h后，96孔板每孔100μL細胞培養(yǎng)基中加入1μL Annexin VFITC、1μL PI、1μL Hoechst 33342，輕輕混勻置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，孵育30 min后置于HCS系統(tǒng)。細胞凋亡形態(tài)實時追蹤選擇谷氨酸濃度750μg／mL處理20 h的N2a細胞，用NucRed Live 647和Annexin V－FITC標(biāo)記。

圖像獲取、處理和數(shù)據(jù)分析 分別使用60×、20×、40×物鏡（LWD），每孔選取10個視野分FITC、PI和Hoechst 33342等3個熒光通道拍攝圖片，熒光光源為250 W連續(xù)氙燈。恒溫37℃、5%CO2下連續(xù)拍攝活細胞實時成像圖片。每隔0．5 h拍攝FITC和NucRed Live 647等2個熒光通道圖片，連續(xù)采集記錄6 h Time－lapse圖像，從T0～T12。同時啟動系統(tǒng)遠紅外激光自動對焦功能，防止長時間拍攝過程中焦點的漂移和維持焦平面穩(wěn)定。

使用HCS系統(tǒng)Operetta中的Columbus軟件來獲取圖像，并對圖像進行參數(shù)調(diào)整以及生成顯微縮時序列圖，通過Hoechst 33342或NucRed Live 647找到細胞核，分別計算細胞總數(shù)、FITC熒光強度和早期凋亡細胞比例、胞核NucRed Live 647熒光染色面積以及熒光強度變異系數(shù)（coefficient of variation，CV），CV＝（標(biāo)準(zhǔn)差÷平均值）×100%。對于谷氨酸對N2a細胞凋亡的影響和谷氨酸誘導(dǎo)N2a細胞凋亡的形態(tài)學(xué)動態(tài)追蹤，各重復(fù)3次獨立實驗，每孔統(tǒng)計的細胞總數(shù)為417～1 176個，使用Excel結(jié)合SigmaPlot軟件計算±s并作二維折線圖。組間差異比較采用t檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

谷氨酸對N2a細胞凋亡的影響 在N2a細胞凋亡的檢測中，Hoechst 33342標(biāo)記細胞核（藍色），Annexin V－FITC標(biāo)記胞膜上外翻的磷脂酰絲氨酸（綠色），PI標(biāo)記胞膜完整性被破壞的凋亡晚期細胞或壞死細胞的胞核（紅色）。于谷氨酸處理24 h后，在細胞培養(yǎng)液中加入上述染色劑，利用HCS技術(shù)捕捉和分析細胞凋亡不同階段的特征，并統(tǒng)計不同濃度谷氨酸誘導(dǎo)的N2a細胞發(fā)生早期凋亡的比例。

谷氨酸誘導(dǎo)的N2a細胞凋亡在不同階段的特征 谷氨酸處理N2a細胞24 h后，利用HCS技術(shù)可以捕捉到細胞凋亡在不同階段的特征。其中，未發(fā)生凋亡的細胞僅胞核被Hoechst 33342染色（藍色）（圖1A）；細胞凋亡早期胞核被 Hoechst 33342染色（藍色），胞膜被 AnnexinV－FITC染色（綠色）（圖1B）；細胞凋亡中晚期胞核同時被 Hoechst 33342（藍色）和PI（紅色）染色，胞膜被AnnexinVFITC染色（綠色）（圖1C、D）。

圖1 谷氨酸誘導(dǎo)的N2a細胞凋亡在不同階段的特征圖像（×60）Fig 1 Characteristic images of N2acells at different apoptotic periods induced by glutamate（×60）

不同谷氨酸濃度誘導(dǎo)對N2a細胞早期凋亡比例的影響 隨著谷氨酸誘導(dǎo)濃度的增加，早期凋亡細胞比例逐漸增加。當(dāng)谷氨酸濃度為750μg／mL時，早期凋亡細胞比例達到峰值42．07%；當(dāng)谷氨酸濃度為1 000μg／mL時，早期凋亡細胞比例開始減少（圖2、3）。這可能與較高濃度谷氨酸誘導(dǎo)下直接進入壞死狀態(tài)的細胞增多以及凋亡晚期進入壞死期細胞的增加有關(guān)。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，未加谷氨酸組和加不同濃度谷氨酸組之間數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。

圖2 不同濃度谷氨酸誘導(dǎo)下早期凋亡N2a細胞的比例Fig 2 The percentage of early apoptotic N2acells induced by different concentrations of glutamate

圖3 不同濃度谷氨酸誘導(dǎo)下早期凋亡N2a細胞比例的變化（×20）Fig 3 The percentage of early apoptotic N2acells induced by different concentrations of glutamate（×20）

谷氨酸誘導(dǎo)N2a細胞凋亡的形態(tài)學(xué)動態(tài)追蹤選擇可誘導(dǎo)N2a細胞達凋亡峰值的谷氨酸濃度750μg／mL處理N2a細胞20 h作為拍攝起點，利用HCS系統(tǒng)對N2a細胞凋亡的形態(tài)學(xué)動態(tài)變化進行實時追蹤。由于PI染料不適合長時間染色和追蹤細胞凋亡動態(tài)，我們采用可進行活細胞染色和成像分析的NucRed Live 647標(biāo)記細胞核（紅色），同時結(jié)合Annexin V－FITC標(biāo)記發(fā)生凋亡細胞的胞膜（綠色）。

結(jié)果顯示，隨著拍攝追蹤時間的增加，帶有綠色熒光（Annexin V－FITC）的細胞數(shù)目逐漸增多，即發(fā)生凋亡的細胞數(shù)目增多，而且細胞核逐漸出現(xiàn)碎片化（圖4）。此外，還可以捕捉到同一個細胞發(fā)生凋亡的動態(tài)過程（圖4中白色三角和箭頭分別標(biāo)示了兩個細胞的凋亡動態(tài)變化）。與之相對應(yīng)，隨著拍攝追蹤時間的增加，胞核的紅色熒光（NucRed Live 647）強度不均一且熒光強度CV逐漸增大（圖5A），凋亡細胞的胞核面積逐漸縮小（圖5B）。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，未加谷氨酸組和加不同濃度谷氨酸組之間數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。

圖4 谷氨酸誘導(dǎo)N2a細胞凋亡的形態(tài)學(xué)實時追蹤（×40）Fig 4 The morphological real－time tracking images of apoptotic N2acells induced by glutamate（×40）

圖5 凋亡的N2a細胞的胞核熒光強度CV值（A）及胞核面積（B）隨谷氨酸誘導(dǎo)時間的變化Fig 5 CV of nucleus fluorescence intensity of glutamate induced apoptotic N2acells at different induction time

討 論

有研究報道［9－10］，離體培養(yǎng)的大腦皮層膠質(zhì)細胞經(jīng)不同濃度谷氨酸刺激后分別引起細胞的壞死和凋亡，低濃度谷氨酸（1×10－3mol／L）即可誘導(dǎo)膠質(zhì)細胞發(fā)生凋亡，隨著谷氨酸濃度的增高，凋亡細胞數(shù)目逐漸增多，但高濃度谷氨酸（1×10－2mol／L）則使膠質(zhì)細胞的死亡方式以壞死為主。本實驗選取介于兩者之間的濃度250、500、750、1 000μg／mL（1．7～6．8×10－3mol／L）作為谷氨酸的誘導(dǎo)劑量，摸索其誘導(dǎo)N2a細胞凋亡達到峰值的濃度。通過HCS分析結(jié)合活細胞實時成像跟蹤拍攝，可以捕捉到谷氨酸誘導(dǎo)后N2a細胞凋亡的形態(tài)學(xué)動態(tài)變化過程，包括從活細胞（Hoechst 33342＋／AnnexinV－／PI－）進入凋亡早期（Hoechst 33342＋／AnnexinV＋／PI－）的胞膜磷脂酰絲氨酸外翻、細胞核凝縮狀態(tài)，進一步進入細胞核碎裂的凋亡晚期（Hoechst 33342＋／AnnexinV＋／PI＋）等各個階段。

HCS分析系統(tǒng)通過全自動高速顯微成像在短時間內(nèi)生成大量的圖像，全自動圖像分析從這些圖像中提取大量的數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)管理軟件負(fù)責(zé)建檔存儲、注釋比較、檢索分享這些圖像和數(shù)據(jù)。高內(nèi)涵分析軟件具有預(yù)設(shè)解決方案（ready－made solutions），預(yù)先安裝常用圖像分析方法和預(yù)設(shè)數(shù)據(jù)處理方案，如發(fā)現(xiàn)胞核、發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)、發(fā)現(xiàn)斑點、選擇細胞區(qū)域、計算圖像紋理密度特性數(shù)據(jù)、計算熒光特性數(shù)據(jù)、計算形態(tài)學(xué)特性數(shù)據(jù)等，不僅能獲取大量細胞形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)，而且能對其進行有效的管理和分析［11－12］。

HCS分析不僅能夠像傳統(tǒng)流式細胞儀那樣對樣品進行群體分析，而且還可以對群體分析中具有特定數(shù)值特征的細胞進行形態(tài)學(xué)觀察和數(shù)值檢測，如對細胞核熒光強度變異系數(shù)以及胞核面積大小的改變等形態(tài)學(xué)指標(biāo)進行定量檢測。HCS分析結(jié)合活細胞實時成像技術(shù)可直觀清晰地追蹤拍攝谷氨酸誘導(dǎo)N2a細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化特征，是一種體外追蹤單一神經(jīng)細胞凋亡形態(tài)學(xué)變化的理想方法。該方法也可應(yīng)用于藥物對細胞凋亡的促進或抑制作用的形態(tài)學(xué)變化特征的研究。

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