復(fù)合氨基酸與鋅的螯合研究

周燕芳，鄭澤玲，許麗麗

（韓山師范學(xué)院化學(xué)系，廣東潮州521041）

復(fù)合氨基酸與鋅的螯合研究

周燕芳，鄭澤玲，許麗麗

（韓山師范學(xué)院化學(xué)系，廣東潮州521041）

使用中性蛋白酶對(duì)魚(yú)蛋白粉進(jìn)行酶解，以酶解后得到的氨基酸與鋅離子標(biāo)準(zhǔn)溶液螯合制備復(fù)合氨基酸鋅，并對(duì)制備過(guò)程反應(yīng)液的pH、摩爾比、反應(yīng)時(shí)間等條件對(duì)螯合反應(yīng)的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：在反應(yīng)液pH為6、氨基酸與鋅的摩爾比為3∶1、反應(yīng)時(shí)間為40 min，所得的螯合率為83.58%。并用紅外光譜鑒定了產(chǎn)品。

中性蛋白酶；魚(yú)蛋白；復(fù)合氨基酸；鋅離子；螯合

我國(guó)水域遼闊，魚(yú)類(lèi)資源十分豐富，魚(yú)類(lèi)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，蛋白質(zhì)含量豐富，是一種優(yōu)質(zhì)動(dòng)物蛋白資源，深受人們喜歡。隨著近年來(lái)市場(chǎng)對(duì)魚(yú)產(chǎn)品多樣化的需求增加，加速了我國(guó)魚(yú)類(lèi)加工業(yè)的發(fā)展。在目前，海洋捕撈所得的小雜魚(yú)類(lèi)的產(chǎn)量不斷增加，占到漁獲物的28%。此外，隨著對(duì)水產(chǎn)品加工研究的深入，其加工比例將會(huì)越來(lái)越大，產(chǎn)生的下腳料也會(huì)越來(lái)越多，例如，生產(chǎn)100 t冷凍魚(yú)糜約需400 t原料魚(yú)，但要產(chǎn)生200 t～250 t下腳料。這些下腳料中除了含有大量的蛋白質(zhì)，還含有多種生物活性物質(zhì)。如何深度開(kāi)發(fā)這些資源，對(duì)于水產(chǎn)品加工綜合利用具有重要意義，而且也能支持和促進(jìn)水產(chǎn)捕撈和養(yǎng)殖生產(chǎn)的發(fā)展［1-2］。

人體機(jī)體缺鋅會(huì)導(dǎo)致基礎(chǔ)代謝下降、蛋白質(zhì)利用率降低、食欲與消化功能低下、影響生長(zhǎng)發(fā)育等多方面的負(fù)面影響［3］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，占世界人口17.3%的人群處于鋅缺乏狀態(tài)［4］。機(jī)體缺鋅主要是兩個(gè)方面的因素：一是食物中的鋅吸收抑制劑的存在，二是食物中鋅含量或吸收不足［5］。近年研究成果發(fā)現(xiàn)，真正在體內(nèi)發(fā)揮作用的是有機(jī)鋅而不是無(wú)機(jī)鋅［3］。而魚(yú)蛋白經(jīng)過(guò)酶解，分解成被小腸直接吸收的小肽與一些具有生理功能的活性肽及部分游離氨基酸，與鋅離子螯合生成肽和氨基酸鋅。但是由于生產(chǎn)微量元素氨基酸螯合物成本較高也是制約其發(fā)展的因素，因此開(kāi)發(fā)新工藝、新方法的研究尤為重要［6］。本試驗(yàn)對(duì)酶解復(fù)合氨基酸鋅的制備進(jìn)行了研究，以期為小雜魚(yú)類(lèi)和水產(chǎn)品加工下腳料的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮低值海魚(yú)：購(gòu)于潮州市橋東市場(chǎng)；木瓜蛋白酶：BR，江西銳陽(yáng)生物科技有限公司，酶活力80萬(wàn)U/g；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

800型離心機(jī)：上海手術(shù)器械廠；電子天平；SHZD（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠；SHP501超級(jí)恒溫槽：上海恒平科學(xué)儀器有限公司；KDN型調(diào)溫電熱套：常州國(guó)華儀器有限公司；電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；半微量凱氏定氮儀：泰興市銘泰科教儀器設(shè)備有限公司；WQF-400傅立葉紅外光譜儀廠商：北京瑞利分析儀器公司。

2 方法和工藝流程

2.1 方法

總氮采用凱氏定氮法［7］；

氨基態(tài)氮采用雙指示劑甲醛滴定法［8］；

鋅含量的測(cè)定采用EDTA滴定法；

鋅的螯合率（%）=（螯合物中鋅的含量/反應(yīng)體系中鋅的含量）*100%

產(chǎn)品的測(cè)定紅外光譜法［9］。

2.2 工藝

2.2.1 原料預(yù)處理

將新鮮魚(yú)蒸熟→溶劑萃取脫去脂肪→65℃干燥→研細(xì)→魚(yú)粉（供酶解用）。

2.2.2 酶解流程［10-11］

將魚(yú)粉稱(chēng)量→加酶、加水→調(diào)節(jié)pH→調(diào)溫→進(jìn)行酶解→滅酶→離心→得到酶解液（取酶解液測(cè)定游離氨基氮含量）。

2.2.3 螯合工藝流程

酶解液→調(diào)節(jié)pH→加鋅離子→調(diào)溫→螯合一定時(shí)間→濃縮→乙醇析出→干燥→復(fù)合氨基酸鋅。

3 結(jié)果與分析

3.1 魚(yú)粉的酶解實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取適量魚(yú)粉，加入用量為0.5%的中性酶，按底物濃度3.5%的量加水后攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH為7，置于55℃水浴加熱4 h移至沸水中滅酶10 min，離心取上清液即為酶解液。通過(guò)雙指示劑甲醛滴定法測(cè)得酶解液中游離氨基氮的摩爾濃度為0.039 mol/L。

3.2 復(fù)合氨基酸鋅的螯合研究

3.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

3.2.1.1 不同pH對(duì)螯合反應(yīng)的影響

在室溫（25℃）下，配制氨基酸與鋅離子的摩爾比為3∶1，分別在pH為5、5.5、6、7的條件下進(jìn)行螯合，反應(yīng)50 min后，對(duì)螯合液進(jìn)行濃縮、加無(wú)水乙醇處理，使復(fù)合氨基酸鋅以沉淀析出，然后干燥，并對(duì)鋅離子濃度進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算出螯合率，以研究pH對(duì)鰲合反應(yīng)效果的影響，結(jié)果如圖1。

圖1 pH對(duì)螯合反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of pH on the chelating reaction

從圖中可以看出，復(fù)合氨基酸與鋅離子的螯合，在不同pH條件下螯合率大小不一樣，由于pH過(guò)大的話，鋅離子容易形成沉淀，所以在弱酸性條件下，進(jìn)行螯合是比較合適的。

3.2.1.2 摩爾比對(duì)螯合反應(yīng)的影響

在室溫下，pH為7，分別配制氨基酸與鋅離子的摩爾比為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1的四種反應(yīng)混合液進(jìn)行反應(yīng)，50 min后對(duì)混合液進(jìn)行處理，并對(duì)鋅離子濃度進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算螯合率，以研究摩爾比對(duì)螯合反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 摩爾比對(duì)螯合反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of mole ratio on the chelating reaction

從圖2的結(jié)果可以看出，復(fù)合氨基酸與鋅離子的螯合，在不同摩爾比的情況下螯合率不一樣，在復(fù)合氨基酸與鋅離子的摩爾比為3∶1時(shí)螯合率達(dá)到最大，可見(jiàn)氨基酸與鋅離子在物質(zhì)的量比為3∶1時(shí)有較好螯合，因此，選用3∶1作為氨基酸與鋅離子的最佳螯合摩爾比。

3.2.1.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)螯合反應(yīng)的影響

在室溫下，分別配制4份氨基酸與鋅離子摩爾比均為3∶1的反應(yīng)液，并調(diào)節(jié)pH為7，進(jìn)行螯合反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間分別為30、40、50、60 min，反應(yīng)結(jié)束后按照2.2中的過(guò)程進(jìn)行螯合率的測(cè)定，以研究時(shí)間對(duì)鰲合反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)螯合反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of reaction time on the chelating reaction

從圖3可以看出，螯合反應(yīng)一開(kāi)始隨著時(shí)間的增加，在30 min～50 min內(nèi)呈上升趨勢(shì)，當(dāng)時(shí)間超過(guò)50 min后，螯合率不再增加，可見(jiàn)，從經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)，螯合時(shí)間選定在50 min以?xún)?nèi)比較合適。

3.2.2 最佳螯合條件的研究

3.2.2.1 正交實(shí)驗(yàn)分析［12］

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，為了研究pH、摩爾比、螯合時(shí)間對(duì)螯合反應(yīng)的綜合影響，采用pH5～7、氨基酸與鋅的摩爾比2∶1～4∶1、反應(yīng)時(shí)間40 min～60 min的進(jìn)行L9（33）三因素三水平正交試驗(yàn)，以找出最佳螯合條件，正交結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果和極差分析表Table 1 Orthogonal experiment and variance analysis table of the results

從表1可看出，3種因素對(duì)螯合率的影響大小順序?yàn)槟柋龋緋H＞反應(yīng)時(shí)間，九組試驗(yàn)中螯合率最大的試驗(yàn)組合是A2B3C1，為81.21%。而根據(jù)均值正交結(jié)果分析，最佳試驗(yàn)組合為A2B2C1，但該組合沒(méi)出現(xiàn)在正交表里，因此要進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。

3.2.2.2 最佳螯合條件驗(yàn)證

最佳螯合條件組合為A2B2C1，即pH6、氨基酸與鋅的摩爾比為3∶1、反應(yīng)時(shí)間為40 min，在這三個(gè)條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出在該條件組合下螯合率為83.58%，大于9組正交實(shí)驗(yàn)中最大的螯合率81.21%，所以該正交實(shí)驗(yàn)成功。因此最佳螯合條件為A2B2C1，即pH6、氨基酸與鋅的摩爾比為3∶1、反應(yīng)時(shí)間為40 min。

3.3 產(chǎn)物的紅外圖譜分析［13］

以KBr為分散劑，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物與魚(yú)蛋白粉進(jìn)行紅外圖譜分析，結(jié)果如圖4和圖5所示。

圖4 魚(yú)蛋白粉的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrum of fish protein powder

圖5 產(chǎn)品的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spetrum of product

由紅外圖譜可知，產(chǎn)物的紅外圖譜增多，且譜帶發(fā)生移動(dòng)。由紅外光譜的-NH-鍵在3300cm-1～3000cm-1出現(xiàn)吸收峰，可知魚(yú)蛋白粉的-NH-鍵的吸收峰出現(xiàn)在3 292.49 cm-1，而產(chǎn)品的-NH-鍵出現(xiàn)在3 298.28 cm-1，波數(shù)變大，向短波移動(dòng)。而紅外光譜中C=O鍵在1 680 cm-1～1 750 cm-1出現(xiàn)吸收峰，知魚(yú)蛋白粉的C=O鍵的吸收峰在1 649.14 cm-1，而產(chǎn)品的C=O鍵出現(xiàn)在1 647.21 cm-1，波數(shù)變小，向長(zhǎng)波移動(dòng).表明了-NH-鍵和C=O鍵發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，鋅與給電子的N形成來(lái)了配位鍵，又與給電子的羰基中的氧配位形成五元環(huán)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)中性酶水解魚(yú)蛋白粉，在用量為0.5%的中性酶、按底物濃度為3.5%、酶解pH為7、酶解時(shí)間為4 h、酶解溫度為55℃的條件下酶解得到酶解液。

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法，探究pH、摩爾比、反應(yīng)時(shí)間對(duì)螯合反應(yīng)的影響，得出了復(fù)合氨基酸與鋅離子的最佳螯合條件是A2B2C1，即pH為pH6、氨基酸與鋅離子的摩爾比為3∶1、反應(yīng)時(shí)間為40 min，螯合率最高可達(dá)到83.58%。

利用紅外光譜法對(duì)魚(yú)蛋白粉和產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品的-NH-鍵的吸收峰向短波移動(dòng)，C=O鍵的吸收峰向長(zhǎng)波移動(dòng)，兩種化學(xué)鍵發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，鋅離子和-NH-和C=O形成五元環(huán)，合成了氨基酸鋅螯合物。

本研究利用低值魚(yú)蛋白經(jīng)過(guò)酶解，獲得游離氨基酸與鋅離子發(fā)生螯合反應(yīng)生成氨基酸鋅。最佳的螯合率可達(dá)83.58%，說(shuō)明低值魚(yú)蛋白對(duì)我們的利用價(jià)值很高，是很豐富的蛋白質(zhì)資源，本研究對(duì)于進(jìn)一步提高低值魚(yú)蛋白的附加值甚至對(duì)于更有效利用水產(chǎn)資源有一定的意義。

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Study on Chelating Compound Amino Acid and Zinc Ion

ZHOU Yan-fang，ZHENG Ze-ling，XU Li-li（Chemical Deparment，Hanshan Normal University，Chaozhou 521041，Guangdong，China）

Compound amino acid were obtained from the hydrolysis of fish protein with neutral protease，and were chelated with zinc ion.The chelating conditions were studied.The effects of pH，molar ratio，reaction time on the chelating reaction were investigated.The results showed that when the pH of the reaction solution was 6，the molar ratio was 3∶1，and the time was 40 minutes，the percent chelation was over 83.58%.The product was characterized by IR.

neutral protease；compound amino acid；zinc ion；chelate；synthesis condition

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.003

2013-12-15

韓山師范學(xué)院青年基金項(xiàng)目（LQ201101）

周燕芳（1979—），女（漢），高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，本科，研究方向：蛋白質(zhì)的酶解。