M48磁珠法提取脫落細胞DNA的改良方法

1.晉江市公安局物證鑒定室 2.浙江省臺州市公安司法鑒定中心 3.泉州市公安局物證鑒定所

王 芳 1 李 達 2 程 沖 3 劉 超 1

隨著犯罪分子反偵察手段的提高，在犯罪現(xiàn)場提取到指掌紋和肉眼可見的生物物證概率不斷降低，但是來自人體正常新陳代謝過程中的脫落細胞，由于肉眼不可見，常常被犯罪分子忽略掉，因此，如何成功、快速地檢驗出犯罪嫌疑人在現(xiàn)場遺留的脫落細胞 DNA就成為破案的一個新手段。日常檢案中，大部分地區(qū)均采用M48磁珠法提取DNA[1-2]，常規(guī)M48磁珠法提取DNA步驟較為繁瑣，耗時較長，而本文采用改良M48磁珠法進行DNA提取，可以縮短提取時間，并能保證提取質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗選用的50例煙蒂、50例作案工具（螺絲刀柄、匕首柄、老虎鉗柄）、50例紡織品（手套、衣服等）均為案件物證，煙蒂用直接剪取后備檢，紡織品用脫落細胞粘取器粘取后備檢，作案工具用干濕兩步擦拭法擦拭后備檢。

50例煙蒂、50例作案工具、50例紡織品的每個樣品各選取 2份，分別用常規(guī) M48磁珠法和優(yōu)化后的磁珠法提取DNA，然后用9700擴增（體系為10μL），AB公司的3130型遺傳分析儀進行測序。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)M48磁珠法

取檢材放入1.5mL離心管中，加入190μL緩沖液G2，加入10μL蛋白酶 K，漩渦振蕩 10秒，56℃孵育 2小時，13000rpm離心5分鐘，轉(zhuǎn)移200μL上清液到1.5mL樣品管中，按文獻[2]中M48法提取純化上清液DNA，4℃保存?zhèn)溆脭U增。

1.2.2 改良的M48磁珠法

取檢材放入1.5mL離心管中，加入190μL緩沖液G2，加入10μL蛋白酶K，漩渦振蕩10秒，56℃孵育2小時（特殊檢材延長孵育時間），13000rpm離心5分鐘，轉(zhuǎn)移200μL上清液到1.5mL樣品管中，在樣品管中加入 MTL，MTL：樣品溶液=3∶1，加入30μL磁珠（若碰到極微量物證，可加入1μL的載體RNA），充分混勻溶液，用搖勻儀搖15分鐘，混勻后將樣品管放在磁力架上，使磁力架和樣品顛倒 2、3次，一一打開樣品管蓋，用雙手夾緊樣品管，快速垂直傾倒溶液（可一次性倒出 6個樣品管內(nèi)溶液），用吸瓶加入約500mL 75%乙醇溶液，搖勻樣品溶液，將樣品管放在磁力架上，使磁力架和樣品顛倒2～3次，一一打開樣品管蓋，用雙手夾緊樣品管，快速垂直傾倒溶液，此洗滌過程重復(fù)2次，最后一遍洗滌后應(yīng)去除所有洗滌液，將樣品管放入恒溫儀65℃恒溫10分鐘，加入30μL去離子水，65℃恒溫10分鐘，期間振蕩2～3次，最后13000rpm離心3分鐘，4℃保存?zhèn)溆脭U增。

1.2.3 方法比較

改良后的M48磁珠法省略了MW1溶液及一次酒精洗滌過程，使用快速傾倒溶液法及用吸瓶加液法。

2 結(jié)果

常規(guī)和改良的M48磁珠法提取三種脫落細胞DNA，STR檢驗成功數(shù)無顯著性差異，如圖1所示。

圖1 二種方法提取三種脫落細胞DNA STR檢驗成功數(shù)

常規(guī)和改良的M48磁珠法提取三種脫落細胞DNA，獲得的STR分型無顯著性差異。一起盜竊案件現(xiàn)場手套采用二種方法提取DNA結(jié)果見圖2、圖3。

常規(guī)M48磁珠法提取純化DNA的時間平均44m/個，而改良的M48磁珠法提取純化DNA的時間平均38m/個。

圖2 一起盜竊案件現(xiàn)場手套用常規(guī)M48磁珠法提取DNA的STR圖譜

圖3 一起盜竊案件現(xiàn)場手套用改良的M48磁珠法提取DNA的STR圖譜

3 討論

M48磁珠法是利用細胞裂解液促使細胞膜、核膜發(fā)生變化，獲得DNA片段后，通過磁珠作載體在MTL環(huán)境中結(jié)合DNA，而雜質(zhì)不被磁珠吸附或結(jié)合，然后利用磁力架聚集磁珠，雜質(zhì)在濃度80%的乙醇三次洗滌過程中吸棄，最后通過洗脫程序，將磁珠上吸附的 DNA釋放于水中。而在基層檢驗中，濃度75%的乙醇洗滌兩次已足夠去除雜質(zhì)，無需再加入MW1及三次乙醇洗滌，且乙醇的量無需固定500mL，只要能覆蓋吸附在磁力架上的磁珠就行，使用快速傾倒溶液法及用吸瓶加溶液法都大大減少了提取時間，而最后使用13000rpm離心沉淀磁珠，沒有轉(zhuǎn)移樣品管過程中的損耗，也避免了兩次污染，對DNA的回收率高[2]。

綜上，本文實驗結(jié)果顯示，采用改良的M48磁珠法提取純化DNA，不僅為基層辦案贏得寶貴時間，同時在一定程度上減輕DNA檢驗人員的工作量，并能保證提取質(zhì)量。

[1]王彥濤,宋道江.M48磁珠法和Chelex-100提取脫落DNA的初步比較[J].刑事技術(shù), 2013（2）：53-54.

[2]楊電,張麗萍,劉超,等.Chelex-100和兩種磁珠法提取接觸性DNA效果的比較[J].刑事技術(shù), 2012（1）：11-13.