污染河流底泥亞鐵氧化硝酸鹽還原菌分離及代謝特性

謝小蘭，余光偉，種云霄，龍新憲 （華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣東高校污水生態(tài)處理與水體修復(fù)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642）

污染河流底泥亞鐵氧化硝酸鹽還原菌分離及代謝特性

謝小蘭，余光偉，種云霄*，龍新憲 （華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣東高校污水生態(tài)處理與水體修復(fù)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642）

采用常規(guī)分離培養(yǎng)方法，從富含亞鐵厭氧還原態(tài)底泥中分離得到多株亞鐵氧化硝酸還原菌，并從中選取1株:FX-Fe5菌株進(jìn)行詳細(xì)分析研究.經(jīng)革蘭氏染色、光學(xué)顯微鏡及掃描電鏡觀察，該菌為革蘭氏染色陰性長桿菌，經(jīng)16SrRNA測序分析確定為:拉烏爾菌屬種類（Raoultella sp.）.利用亞鐵作為單獨電子供體和亞鐵與不同比例乙酸作為共同電子供體反硝化反應(yīng)液，研究了FX-Fe5菌株對亞鐵、硝酸鹽氮和有機物的代謝特點.結(jié)果表明，F(xiàn)X-Fe5在24h內(nèi)可對亞鐵進(jìn)行較大幅度的去除，去除率（%）分別為:89.77±0.47a（亞鐵與乙酸鹽比例1:1）、87.01±0.22b（亞鐵與乙酸鹽比例3:1）、86.96±0.07b（僅亞鐵）、72.97±0.53c（亞鐵與乙酸鹽比例1:3），高于文獻(xiàn)報道大部分純菌的亞鐵氧化率；亞鐵和乙酸鹽為共同電子供體時，乙酸和亞鐵在硝酸還原過程中同步減少；重復(fù)反應(yīng)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)FX-Fe5菌株在不提供乙酸鹽時，不能持續(xù)地利用亞鐵進(jìn)行硝酸還原反應(yīng).FX-Fe5菌株利用亞鐵對硝酸還原過程中沒有出現(xiàn)明顯的亞硝酸鹽氮和氨的積累，各反應(yīng)體系反應(yīng)氣體中都含有N2O的存在，所占比例都不高，最高的情況不超過0.5%（5000×10-6），但不同電子供體間差別非常大.利用Biology對碳源代謝特點分析表明，F(xiàn)X-Fe5菌株但對單糖/糖苷/聚合糖類優(yōu)先利用且利用程度較高.

厭氧還原態(tài)底泥；亞鐵氧化；硝酸還原

厭氧中性條件下，部分異養(yǎng)反硝化菌可以利用亞鐵為電子供體進(jìn)行硝酸還原［1］，被稱為亞鐵氧化硝酸鹽還原菌或硝酸依賴型亞鐵氧化菌.1996年歐洲學(xué)者Straub［1］在底泥樣品中分離出3種具有該功能的革蘭氏陰性菌株.此后，其他研究者陸續(xù)報道了稻田、濕地、湖泊、海洋沉積物及活性污泥中該類反硝化過程的發(fā)生，研究表明此過程是典型厭氧環(huán)境中鐵、氮循環(huán)的重要步驟［1-6］.此外，由于亞鐵氧化形成鐵（Ⅲ）氧化物對磷、砷等具有很強的吸附特性，因此該過程對環(huán)境中磷、砷等污染物遷移轉(zhuǎn)化具有重要的意義，是目前國內(nèi)外鐵氮循環(huán)、污水處理等環(huán)境科學(xué)與技術(shù)領(lǐng)域研究的熱點.

目前，我國關(guān)于該類功能菌的研究剛剛起步，還沒有純菌分離的報道［7-11］.華南地區(qū)屬于富含鐵鋁的紅壤區(qū)［12］，相應(yīng)的河流沉積物中含有大量的鐵氧化物，許多城市河流長期接納生活污水，使得底泥處于厭氧的黑臭狀態(tài)，其中含有豐富的亞鐵，同時上覆水中氨氧化形成硝酸鹽氮也會向底泥擴散，是亞鐵氧化硝酸鹽還原菌生存的典型環(huán)境條件.

為了探索亞鐵氧化硝酸鹽還原菌在污染河道底泥中的分布，本研究以廣州典型厭氧還原態(tài)（黑臭）河流底泥為研究對象，嘗試從中分離純化具有該類功能的菌株，并分析其對亞鐵和硝酸鹽氮的代謝特點，為進(jìn)一步開發(fā)黑臭河流底泥原位修復(fù)技術(shù)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 底泥的選取及特性

選取廣州市天河區(qū)車陂涌河道底泥，主要理化特征（mg/g鮮重，平均值）:有機質(zhì)為34.583、氨氮0.753、凱氏氮5.796、亞鐵11.635、硫化物0.669.

1.2 亞鐵氧化硝酸鹽還原菌的分離純化及鑒定

1.2.1 富集過程 首次富集稱取100g底泥加入1L四口瓶中，加入900mL常規(guī)異養(yǎng)反硝化細(xì)菌培養(yǎng)液［13］，通氮氣形成無氧環(huán)境，在30℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至硝酸鹽濃度下降，取100mL上述培養(yǎng)液進(jìn)行第2次富集，共重復(fù)3次，得到混合異養(yǎng)反硝化菌液.

1.2.2 分離純化 采用平板及斜面劃線法，對混合菌液進(jìn)行多次分離純化，直至獲得形態(tài)清晰一致的單菌落，然后每種菌分別接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng).

1.2.3 亞鐵氧化硝酸鹽還原菌篩選 利用亞鐵替代傳統(tǒng)異養(yǎng)反硝化培養(yǎng)液組成［13］中的有機物，形成亞鐵為單一電子供體的培養(yǎng)液，對分離出各菌株進(jìn)行篩選，各菌菌液按20%添加量投入1L的四口孔反應(yīng)瓶，通氮氣創(chuàng)造缺氧環(huán)境，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，不同時間底部取樣測定反應(yīng)中液中亞鐵、硝酸鹽氮變化量，篩選出能將培養(yǎng)液中亞鐵氧化50%以上［1］，同時硝酸鹽氮相應(yīng)下降的菌株，從中選取一種命名為FX-Fe5，進(jìn)行深入菌種鑒定及鐵氮代謝特性研究.

1.2.4 FX-Fe5菌種鑒定 形態(tài)分析:對數(shù)生長期細(xì)胞革蘭氏染色后光學(xué)顯微鏡觀察，并進(jìn)一步利用掃描電子顯微鏡觀察形態(tài)（樣品前處理委托廣東省微生物研究所菌種鑒定中心完成，掃描電鏡觀察在華南理工大學(xué)分析測試中心完成）.

菌株16SrRNA序列的測定及系統(tǒng)發(fā)育分析：按文獻(xiàn)常規(guī)方法提取菌液樣品的總DNA，然后以總DNA為模板，采用細(xì)菌16SrRNA通用引物進(jìn)行擴增并測序（整個過程委托廣州華大基因公司完成）.將測序結(jié)果用BLAST軟件與Gen-Bank中已登錄的16S rRNA 序列進(jìn)行同源性比較，進(jìn)行種屬鑒定，采用Clustal X1. 8進(jìn)行多序列比對，MEGA4. 1軟件中的NJ 法構(gòu)建進(jìn)化樹.

1.2.5 FX-Fe5使用不同電子供體進(jìn)行硝酸還原及亞鐵氧化的代謝動力學(xué)分析 電子供體類型:研究表明亞鐵氧化硝酸還原菌通?？梢栽?種情況下對亞鐵進(jìn)行氧化［4］，單獨以亞鐵作為電子供體，或亞鐵和有機物共同作為電子供體，為了考察FX-Fe5這方面的特點，以常規(guī)異養(yǎng)反硝化培養(yǎng)液為基礎(chǔ)［13］，通過改變電子供體類型及數(shù)量比例形成5種不同硝酸還原反應(yīng)液:

（1）僅乙酸（CH3COO-）做為電子供體

（2）僅亞鐵（Fe2+）做為電子供體

（3）乙酸鹽與亞鐵共同作為電子供體，2者按摩爾比投加，比例按還原1mol硝酸鹽氮為氮氣，亞鐵被氧化三價鐵、乙酸被氧化為CO2時，亞鐵和乙酸分別提供電子數(shù)比例確定，共設(shè)定3種典型情況，分別為:

亞鐵與乙酸鹽比例（Fe2+:CH3COO-）:3:1，即還原1mol硝酸鹽氮為氮氣，由亞鐵提供75%電子，乙酸提供25%.

亞鐵與乙酸鹽比例（Fe2+:CH3COO-）:1:1，即還原1mol硝酸鹽氮為氮氣，由亞鐵和乙酸各提供50%電子.

亞鐵與乙酸鹽比例（Fe2+:CH3COO-）:1:3，即還原1mol硝酸鹽氮為氮氣，由亞鐵提供25%電子，乙酸提供75%.

在亞鐵與硝酸鹽氮氧化還原反應(yīng)中，若硝酸鹽氮被還原為氮氣，則2者理論的反應(yīng)量之比為:5:1（摩爾比），即反應(yīng)消耗的亞鐵量遠(yuǎn)高于硝酸鹽氮，根據(jù)前期篩選實驗發(fā)現(xiàn)較高濃度（高于2mmol/L）的亞鐵會對FX-Fe5菌產(chǎn)生抑制作用，反應(yīng)速度較慢，因此配置反應(yīng)液時，亞鐵濃度控制在2mmol/L以下，這也是底泥間隙水中亞鐵離子濃度范圍，然后以亞鐵濃度為基準(zhǔn)，并假定硝酸鹽氮全部為還原為氮氣，再對應(yīng)計算不同情況下乙酸鹽和硝酸鹽氮濃度，由于硝酸鹽氮可能會被同化反硝化，因此投加量略高于理論計算反應(yīng)量.

實驗步驟:反應(yīng)裝置采用125mL的3孔瓶，100mL反應(yīng)液，添加FX-Fe5純菌培養(yǎng)液20mL，通氮氣維持缺氧條件，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).采用破壞性取樣系統(tǒng)，每個反應(yīng)體系隔4h取3瓶樣品測定反應(yīng)中液中亞鐵、硝酸鹽氮、乙酸鹽、亞硝酸鹽氮、氨氮含量，最后剩余3瓶樣品，用12mL抽真空的頂空取樣瓶抽取反應(yīng)液上空氣體測定其中N2O濃度.

已報道的大部分亞鐵氧化硝酸還原菌，在不提供有機碳情況下，不能持續(xù)使用亞鐵做為電子供體進(jìn)行硝酸還原［14］，為了驗證FX-Fe5菌株該方面特點，各反應(yīng)系統(tǒng)中的菌液在初次反應(yīng)后結(jié)束后，繼續(xù)抽取20mL反應(yīng)液作為接種菌液進(jìn)行再次反應(yīng)，重復(fù)4次.

測定方法:各反應(yīng)系統(tǒng)中的亞鐵（包括溶解的Fe2+、吸附Fe2+及與磷酸根等化學(xué)沉淀的結(jié)合態(tài)亞鐵）提取，參考文獻(xiàn)研究結(jié)果［1，10，15］并結(jié)合預(yù)實驗摸索，最終確定使用0.5mol/L鹽酸進(jìn)行浸提，然后采用鄰菲羅林分光光度法測定亞鐵（HJ/T 345-2007），原子吸收法測定總鐵；硝酸鹽氮采用麝香草酚分光光度法（GB/T5750.5-2006）；乙酸鈉采用高效液相色譜法（GB/T 23383-2009），亞硝酸鹽氮采用N-（1-萘）-乙二胺分光光度法（GB/T 7493-1987），氨氮采用納氏試劑法測定（HJ 535-2009）.

N2O測定按照翟曉峰等［16］方法，采用6820型氣相色譜儀（Agilent Technologies， USA）測定，氣相色譜采用ECD 檢測器，HP-PLOT/Q毛細(xì)管柱（J&W GC Columns， Agilent Technologies，USA）. N2O色譜條件:進(jìn)樣口溫度50℃，柱溫50℃，ECD檢測器溫度300℃.用氮氣作為載氣，流量控制在15mL/min，純N2O氣體用做標(biāo)準(zhǔn)氣體，進(jìn)樣量5μL.

1.2.6 碳源利用特點 采用Biology方法分析FX-Fe5碳源利用特性.取稀釋后的菌液加入BiologyECO板，每孔150mL，然后將微平板置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期用酶標(biāo)儀（BIO-RAD Model 550）測定96個孔在590nm下的吸光度，以監(jiān)測顯色反應(yīng)的進(jìn)程.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS11. 5和Exce l進(jìn)行統(tǒng)計分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 FX-Fe5形態(tài)分析及種屬鑒定

2.1.1 形態(tài)分析 FX-Fe5菌株革蘭氏染色為陰性，長桿狀，直徑約0.2μm，長約1μm，見圖1.

2.1.2 種屬鑒定 將擴增的FX-Fe5菌株16S rDNA序列與GenBank 中相關(guān)序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)與拉烏爾菌屬（Raoultella）的Raoultella ornithionlyticaB6、Raoultella ornithionlytica strain KNUC607、Raoultella ornithionlytica strain TSA7等多株解鳥氨酸拉烏爾菌同源性達(dá)到99%以上，初步確定其為拉烏爾菌屬種類:Raoultella sp..

據(jù)文獻(xiàn)［1，4，6，14］報道，具有亞鐵氧化硝酸鹽還原功能的菌是比較多樣的，但被分離純化的菌株不多，目前報道較多的純菌株是屬于細(xì)菌域變形桿菌門（Proteobacteria）的9株細(xì)菌，如Straub［19］從淡水溝渠分離的Acidovorax sp. BrG1和Aquabacterium sp.BrG2菌株、Chaudhuri［18］在豬場氧化塘分離得到Azospiraoryzae strain PS菌株、Edwards等［4］從深海分離的Hyphomonas jannaschiana、Kumaraswamya等［6］從污水處理廠分離的Paracoccus ferrooxidans等.而拉烏爾菌屬（Raoultella）還未被研究報道過具有該功能菌株的存在，本研究是首次發(fā)現(xiàn).

2.2 FX-Fe5菌株對亞鐵、乙酸、硝酸鹽氮代謝特點

由圖2看出，F(xiàn)X-Fe5在在有亞鐵存在4種情況下，反應(yīng)24h后亞鐵都有較大幅度的去除，去除率（%）分別為:89.77±0.47a（亞鐵與乙酸鹽比例1:1）、87.01±0.22b（亞鐵與乙酸鹽比例3:1）、86.96±0.07b（僅亞鐵）、72.97±0.53c（亞鐵與乙酸鹽比例1:3），與僅使用亞鐵做電子供體相比，添加乙酸作為共同電子供體3種情況下，亞鐵與乙酸1:1和3:1都提高了亞鐵去除率，前者達(dá)到顯著差別，而亞鐵與乙酸1:3時，則亞鐵去除率顯著降低，表明添加乙酸添加量過多，也不利于亞鐵的氧化.含有亞鐵4個體系中，反應(yīng)前4h內(nèi)，單以亞鐵做為電子供體情況下，亞鐵下降速度快于其他3種情況，其中亞鐵和乙酸1:3時，亞鐵下降速度最慢，但不管哪種情況，都是前4h亞鐵濃度下降速度最快，后面開始變慢；此外，隨著亞鐵的下降，各反應(yīng)系統(tǒng)中總鐵基本維持不變（數(shù)據(jù)未列出），但反應(yīng)液中逐漸出現(xiàn)紅棕色懸浮物，應(yīng)該是亞鐵氧化形成的三價鐵沉積物.

圖2 FX-Fe5在5類不同電子供體初次反應(yīng)液中亞鐵和乙酸鈉的變化Fig.2 Variation of ferrous and NaAc concentration in five different electron donor selected systems with strain FX-Fe5

圖3 FX-Fe5在5類不同電子供體初次反應(yīng)液中硝酸鹽氮的變化Fig.3 Variation of nitrate concentration in five different electron donor selected systems with strain FX-Fe5

在亞鐵和乙酸作為共同電子供體的3種情況下，反應(yīng)初始4h內(nèi)2者濃度都快速下降，表明2者在反應(yīng)時被同步利用，但不管哪種情況，乙酸的消耗速度都略快于亞鐵，經(jīng)過4h后，各系統(tǒng)中乙酸基本都被完全消耗，主要是由于乙酸同時作為細(xì)胞合成代謝的有機碳源和能量代謝的電子供體的原因.

由圖2和圖3中看出，F(xiàn)X-Fe5各反應(yīng)體系中，反應(yīng)前4h，隨亞鐵和乙酸濃度下降，硝酸鹽氮濃度也快速下降，到后面濃度降低較緩慢，其中僅亞鐵為電子供體情況下，硝酸鹽氮下降速度最慢，而亞鐵與乙酸1:1時，硝酸鹽氮下降速度最快.

重復(fù)反應(yīng)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)（數(shù)據(jù)未列出），有乙酸存在時，F(xiàn)X-Fe5對硝酸還原反應(yīng)都可以持續(xù)進(jìn)行，各反應(yīng)底物消耗速率與初次反應(yīng)接近，但單獨使用亞鐵作為電子供體時，亞鐵消耗速率開始逐漸變慢，轉(zhuǎn)接到第4次時，24h內(nèi)消耗速率已降低到50%以下，這表明FX-Fe5菌株與大部分亞鐵氧化硝酸還原菌代謝特性相同，在不提供有機碳源時，不能持續(xù)地利用亞鐵進(jìn)行硝酸還原反應(yīng).已有研究認(rèn)為主要是2方面原因［19］，首先是這些菌不能使用無機碳作為細(xì)胞增殖的碳源，因此，沒有有機碳源時細(xì)胞不能增殖；其次，是亞鐵氧化形成的三價鐵在pH值中性范圍易在細(xì)胞表面沉積，在細(xì)胞表面形成鐵氧化物外殼，阻礙后續(xù)反應(yīng)進(jìn)行，但也有研究認(rèn)為，一些菌的細(xì)胞可以通過某種機制將表面的鐵氧化物外殼移除，反應(yīng)不能持續(xù)進(jìn)行原因主要是由于菌細(xì)胞老化得不到有效增殖，對于FX-Fe5菌株屬于那種情況還有待進(jìn)一步研究.

2.3 硝酸還原產(chǎn)物分析

對于大部分硝酸還原反應(yīng)來說，亞硝酸鹽氮通常是中間產(chǎn)物，產(chǎn)生后會繼續(xù)被還原，但也有報道發(fā)現(xiàn)某些亞鐵氧化硝酸還原菌只能把硝酸還原為亞硝酸鹽氮［8］.圖4是FX-Fe5各反應(yīng)體系中亞硝酸鹽氮的濃度變化，在其中3個反應(yīng)體系（僅使用亞鐵、亞鐵與乙酸3:1、亞鐵和乙酸1:1）中監(jiān)測到亞硝酸鹽氮生成，但濃度都非常低，最高的是僅使用亞鐵反應(yīng)體系，達(dá)到0.07mmol/L，但遠(yuǎn)低于初始投入硝酸氮濃度（0.45mmol/L），且隨著反應(yīng)進(jìn)行亞硝酸鹽氮濃度都很快下降到接近于0，這表明FX-Fe5菌株在這5種情況下對硝酸鹽還原時，亞硝酸鹽氮都是中間產(chǎn)物而不是最終產(chǎn)物，并且過程中沒有出現(xiàn)較高濃度的積累，生成后很快被繼續(xù)還原.

圖4 FX-Fe5在5類不同電子供體初次反應(yīng)液中亞硝酸鹽氮的變化Fig.4 Variation of nitrite concentration in five different electron donor selected systems with strain FX-Fe5

Weber 等［20］曾經(jīng)使用含有Geobacter and Dechloromonas spp的富集液作為對象，研究厭氧中性條件下，硝酸鹽氮對亞鐵的氧化，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)液中亞鐵和硝酸被消耗的同時，氨氮增加，推測可能這兩類菌可以利用亞鐵把硝酸還原為氨.本研究中5種情況下反應(yīng)液初始都有氨氮作為FX-Fe5菌株生長的氮源，反應(yīng)過程中對氨氮監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，各體系氨氮濃度均呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，反應(yīng)結(jié)束時各體系氨氮濃度接近于0，因此，F(xiàn)X-Fe5菌株在使用這5種類型電子供體對硝酸還原時，還原產(chǎn)物都不是氨氮.

在硝酸生物還原過程中，N2O是除了氮氣外，被廣泛監(jiān)測到的氣態(tài)硝酸還原產(chǎn)物，濃度往往取決于電子供體的情況.對分離的多種亞鐵氧化硝酸還原菌的研究發(fā)現(xiàn)，亞鐵做為電子供體時，N2O是硝酸還原的氣態(tài)產(chǎn)物的組成，但所占比例都不高［17］.本研究中，5類電子供體情況下，F(xiàn)X-Fe5對硝酸還原反應(yīng)氣體中都監(jiān)測到N2O的存在，整體來看，N2O在反應(yīng)氣體中所占比例也都不高，最高的情況不超過0.5%（5000×10-6），但不同電子供體間差別非常大（表1），其中僅使用乙酸鈉和亞鐵與乙酸鈉1:3的情況下，N2O的濃度最低，在20×10-6以下，其余3種情況都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于這個濃度，亞鐵與乙酸鈉1:1情況最高，達(dá)到4717.9×10-6；這些結(jié)果表明，F(xiàn)X-Fe5使用亞鐵作為電子供體還原硝酸鹽氮更容易產(chǎn)生N2O，而且添加乙酸作為共同電子供體、添加量不大時，相比單獨使用亞鐵又更容易產(chǎn)生N2O.

表1 FX-Fe5在5類不同電子供體反應(yīng)氣體中N2O的濃度（×10-6）Table 1 N2O content in five different electron donor selected systems with strain FX-Fe5（×10-6）

2.4 FX-Fe5菌株碳源代謝特性

采用B IOLOG方法分析FX-Fe5對碳源的利用情況，根據(jù)檢測結(jié)果將所利用的碳源分成6類:Ⅰ酸類、Ⅱ單糖糖苷聚合糖類、Ⅲ氨基酸類、Ⅳ酯類、Ⅴ醇類和Ⅵ胺類.ECO微孔板上共有31種碳源，其中酸類8種，單糖糖苷聚合糖類7種，氨基酸類6種，酯類3種，醇類3種，胺類4種.根據(jù)光密度值來判斷菌株對碳源的利用程度，分析3株細(xì)菌對31種不同碳源的利用情況，結(jié)果見表2和表3.

表2 FX-Fe5菌株分別在0h～48h內(nèi)對碳源的利用情況Table 2 Utilization of carbon sources by strain FX-Fe5 at time of 0， 24 and 48h

表3 菌株在72～168h對碳源的利用程度（以O(shè)D590nm表示）Table 3 Utilization of carbon source（shown as OD590nm）by strain FX-Fe5 at time of 72～168h

由表2可知，拉烏爾菌屬（Raoultella）FX-Fe5菌株對6類碳源的均可利用，但都需要經(jīng)過約30h的適應(yīng)期，其中對單糖/糖苷/聚合糖類利用程度較高（表3），其次是酯類，利用程度較差的是酸類.

3 討論

3.1 FX-Fe5菌株與其它亞鐵氧化硝酸還原菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

細(xì)菌域的變形桿菌門是具有有亞鐵氧化硝酸還原功能細(xì)菌集中分布的一個大類群［14］，目前有詳細(xì)報道的9株亞鐵氧化硝酸還原菌的純菌都屬于這一類群，但分屬于不同的綱.本研究FX-Fe5菌株所屬的拉烏爾菌屬（Raoultella）也屬于變形桿菌門，具體是γ-變形桿菌門腸桿菌科［21］，因此本研究發(fā)現(xiàn)，又進(jìn)一步豐富了變形桿菌門中該類功能菌組成.已報道的9株菌中，6株集中于α-變形菌綱，其他3株分屬于另外3個綱，其中屬于γ-變形菌綱的是Straub等［17］分離的熱單胞菌屬的BrG3菌株（Thermomonas.sp.），可見作為亞鐵氧化的硝酸還原菌，F(xiàn)X-Fe5菌株與BrG3菌株有著最近的遺傳親緣關(guān)系，但它們分屬于不同的科，拉烏爾菌屬屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae），而熱單胞菌屬屬于黃單胞菌科（Xanthomonadaceae）［20］，系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究認(rèn)為，這兩個科在有機物特別是糖類降解途徑方面有著較大的差別，因此，F(xiàn)X-Fe5菌株與BrG3菌株在其他生理代謝方面可能具有較大差異.

3.2 FX-Fe5菌株對硝酸鹽氮和亞鐵的代謝特點

研究發(fā)現(xiàn)，大部分亞鐵氧化的硝酸還原菌對硝酸鹽氮還原的產(chǎn)物主要是氮氣和少部分氧化二氮［17，20］，但也有研究發(fā)現(xiàn)，有個別菌株可以將硝酸鹽氮還原為其他產(chǎn)物，如前述地桿菌屬種類將硝酸鹽氮還原為氨，分離自潛艇供熱系統(tǒng)的Ferroglobus placidus將硝酸還原為亞硝酸鹽氮）、二氧化氮（NO2）、一氧化氮（NO）［8］，分離自湖泊底泥的Pseudogulbenkiania sp.可以將硝酸還原為四氧化三氮［8］.本研究由于實驗條件有限，只對氨、亞硝酸鹽氮和氧化二氮3種產(chǎn)物做了分析確定，但從微生物反硝化機制和其他亞鐵氧化硝酸還原菌的反硝化產(chǎn)物來看，氧化二氮很多時候是反硝化為氮氣過程中的中間產(chǎn)物，一定程度上是產(chǎn)氮氣的反硝化過程不完全導(dǎo)致的，本研究中各反應(yīng)體系中所產(chǎn)生氣體中都含有氧化二氮，但含量并不高，表明氣體產(chǎn)物應(yīng)該不以氧化二氮為主，而是氮氣為主.

本研究中，除了亞鐵與乙酸1:3情況，其他含亞鐵的反應(yīng)系統(tǒng)中，亞鐵氧化率在24h內(nèi)達(dá)到80%以上，氧化速率和氧化率都高于文獻(xiàn)報道大部分亞鐵氧化硝酸還原過程［1-6］，特別是僅采用亞鐵做為電子供體的情況，可能與本研究采用亞鐵離子濃度較低（2mmol/L）有關(guān)，其他分離純菌研究多采用5～10mmoL/L亞鐵離子濃度，亞鐵氧化硝酸還原菌達(dá)到50%以上往往需要2d以上時間.

根據(jù)已有研究，大部分亞鐵氧化硝酸還原菌在提供少量有機物作為共同電子供體時，相比僅使用亞鐵做為電子供體，亞鐵的氧化速率及氧化率都會提高，如HidR2and BrG1菌株［1］，不添加乙酸時在4周內(nèi)將9mmoL/L的亞鐵離子氧化不到50%，而添加1mmoL/L乙酸，則可以1周內(nèi)將9mmoL/L的亞鐵氧化60%，對BoFeN1菌株研究發(fā)現(xiàn)，亞鐵氧化率隨乙酸添加量增加而增加，但超過0.5mmL/L時，則不再增加而是處于基本穩(wěn)定狀態(tài)［21］.本研究FX-Fe5菌株，提供適當(dāng)含量的乙酸（亞鐵和乙酸各提供50%電子時），亞鐵氧化率顯著提高，但氧化速率并不比僅使用亞鐵作為電子供體時高，同時過高的乙酸濃度（乙酸可提供三分之二電子時）反而降低了亞鐵氧化率.

在有機物作為共同電子供體時，2種電子供體被硝酸氧化的順序，F(xiàn)X-Fe5菌株也與已有研究不同，對Azospira oryzae strain PS和BoFeN1菌株研究［18，22］發(fā)現(xiàn)，其在有機物作為共同電子供體時，硝酸鹽氮優(yōu)先氧化有機物，然后再氧化亞鐵，即亞鐵的消耗在反應(yīng)開始后有一個滯后期；而本研究FX-Fe5菌株是對2者同步利用，但是乙酸首先被消耗完，由于乙酸也可能是被同化，即用來作為新細(xì)胞合成碳源，因此提供的乙酸并不是或不完全是被用作硝酸鹽氮還原電子供體，具體機制也有待進(jìn)一步研究.

3.3 FX-Fe5菌亞鐵氧化硝酸還原過程在環(huán)境治理中潛在應(yīng)用

3.3.1 富含亞鐵城市污染河流底泥修復(fù) 本研究FX-Fe5菌是分離自富含亞鐵的城市河流底泥，這種類型的底泥往往是城市河流接受含有大量有機耗氧污染物的生活污水后，水中溶解氧被消耗從而發(fā)生厭氧還原的結(jié)果，還原形成的亞鐵離子是底泥中主要還原態(tài)污染物，對多種底棲水生生物具有危害［23］，河流要恢復(fù)健康生態(tài)系統(tǒng)首先要將其氧化形成相對安全的三價鐵沉積物.但這種富含亞鐵的厭氧還原態(tài)底泥往往是廣州等華南地區(qū)受污染城市河流修復(fù)的難點，即使排入河流外源污水被切斷，河水中溶解氧逐漸恢復(fù)或人為向河流強化曝氣充氧，由于溶解氧向底泥間隙水?dāng)U散速度較慢，底泥中的亞鐵較難被大量氧化，致使底泥仍會長時間保持厭氧還原狀態(tài)，不利于健康水生生態(tài)系統(tǒng)重建.而亞鐵氧化硝酸還原過程為這種污染河流底泥的快速原位修復(fù)提供了可能，因為處于厭氧還原態(tài)底泥中同樣富含有機物厭氧水解形成的小分子有機物，有硝酸鹽氮存在時可能發(fā)生這種伴隨亞鐵氧化的硝酸還原過程.

與溶解氧相比，硝酸鹽氮在水中具有更高的擴散速度，是一個更有效的氧化劑，因此可以基于微生物的亞鐵氧化硝酸還原代謝特點，開發(fā)相應(yīng)底泥的原位修復(fù)技術(shù).實際上，國內(nèi)外已經(jīng)有關(guān)的技術(shù)嘗試，即通過向底泥注入外源硝酸鈣氧化底泥［24-25］，作者所在研究小組也在進(jìn)行相關(guān)的技術(shù)研究，但由于基本生物化學(xué)代謝機制缺乏充足的認(rèn)識，該項技術(shù)目前存在較大的不確定性，較難以實際應(yīng)用，由于硝酸鹽氮同樣是水體污染物，該項技術(shù)面臨最主要的問題在于外源硝酸鹽氮投入是否會增加水體氮負(fù)荷，如何確保其都能夠被反硝化為氮氣等氣態(tài)產(chǎn)物？本研究對FX-Fe5菌的亞鐵和硝酸鹽氮的代謝特性表明在短時間（24h）內(nèi)，該菌可以將底泥間隙水中亞鐵利用硝酸鹽氮氧化，參與反應(yīng)硝酸鹽氮主要形成氣態(tài)產(chǎn)物，但如何利用FX-Fe5菌開發(fā)安全環(huán)保的底泥硝酸鹽氮氧化技術(shù)還需要深入研究.

3.3.2 水中其他污染物的去除 亞鐵氧化形成三價鐵礦物可通過共沉淀或吸附方式固定磷酸鹽、砷酸鹽、鎘離子等污染，因此厭氧中性條件下，生物亞鐵氧化硝酸還原過程被發(fā)現(xiàn)以來，已有較多的研究嘗試?yán)脕嗚F氧化硝酸還原菌的代謝進(jìn)行水中這些污染物的去除，特別是砷的去除一直是關(guān)注和研究的熱點［26-29］.砷是某些地下水或礦山廢水中主要污染物，具有較大的污染危害，在我國許多地區(qū)飲用水遭受嚴(yán)重的砷污染.本研究的FX-Fe5菌在提供乙酸的情況下可將水中接近90%的亞鐵離子氧化生成三價鐵氧化物，因此在地下水除砷等方面也具有較大的應(yīng)用潛力.

4 結(jié)論

4.1 從富含亞鐵的城市河流底泥中分離出了一株具有亞鐵氧化功能的硝酸鹽還原菌——FX-Fe5菌.經(jīng)鑒定，該菌為革蘭氏染色陰性長桿菌，屬于γ-變形桿菌門腸桿菌科拉烏爾菌屬種類（Raoultella sp.）.

4.2 FX-Fe5菌株在24h內(nèi)可對亞鐵較大幅度的去除，最高去除率可達(dá)到89.77±0.47%（亞鐵與乙酸鹽比例1:1）.當(dāng)亞鐵和乙酸鹽為共同電子供體時，乙酸和亞鐵在硝酸還原過程中同步減少；而不提供乙酸鹽時， FX-Fe5菌株不能持續(xù)地利用亞鐵進(jìn)行硝酸還原反應(yīng). 此外，F(xiàn)X-Fe5菌株利用亞鐵對硝酸還原過程中沒有出現(xiàn)明顯的亞硝酸鹽氮和氨的累積，同時各反應(yīng)體系反應(yīng)氣體中雖檢測到N2O，但所占比例均低于0.5%（5000×10-6），表明氣體產(chǎn)物不以氧化二氮為主.

4.3 Biology實驗表明FX-Fe5菌株對單糖/糖苷/聚合糖類優(yōu)先利用且利用程度較高.

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XIE Xiao-lan， YU Guang-wei， CHONG Yun-xiao*， LONG Xin-xian （College of Natural Resource and Environment， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China）. China Environmental Science，2015，35（5）：1554～1562

Several Fe（II）-oxidizing denitrifying bacteria （FODBs） were isolated from iron-rich anaerobic river sediments using the conventional cultivation method， and one of the FODBs named strain FX-Fe5was selected for further study. Based on the observation of gram staining， optical microscope and scanning electron microscope， and identification by 16s rRNA sequencing， strain FX-Fe5 was as gram-negative bacillus and was most closely related to Raoultella sp.， which was the first time to be reported as FODBs. Strain FX-Fe5could efficiently oxide ferrous iron within 24h， when ferrous and acetic acid were supplied as electron donor separately or jointly. The oxidation rates of Fe（II） （%） in different electron donor systems were 89.77±0.47（ratio of ferrous to acetate was 1:1）， 87.01±0.22 （ratio of ferrous to acetate was 3: 1）， 86.96±0.07 （ferrous only） and 72.97±0.53（ratio of ferrous to acetate was 1:3）， respectively. The oxidation rates of Fe（II） were all higher than those of pure isolates reported by other studies. In addition， the concentration of ferrous and acetic acid decreased simultaneously， when both of them were supplied as electron donor during the process of denitrification. However， the Fe oxidation process was limited when ferrous was used as a single electron. Furthermore， during the denitrification process driven by strain FX-Fe5， only N2O gas was observed， without nitrite and ammonium accumulation in the reaction system. Otherwise， the highest content of N2O gas was less than 0.5% （5000×10-6）， and varied largely with different electron donor systems. Carbon source metabolism analysis using Biolog EcoplateTM confirmed that strain FX-Fe5 had a higher preference to use monosaccharide， indican and polymerization sugars as carbon source.

anaerobic sediments；Fe-oxidizing；nitrate reduction

X172，X522

A

1000-6923（2015）05-1554-09

謝小蘭（1988-），女，廣西南寧人，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院碩士研究生，主要研究方向為水污染防治與控制.

2014-09-21

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（51108196）

* 責(zé)任作者， 副教授， cyx04@scau.edu.cn