2011～2014年安徽省發(fā)病雞群H9亞型禽流感病毒HA基因的遺傳進(jìn)化分析

胡曉苗，胡順林，陳鴻志，劉 東，戴 銀，沈?qū)W懷，劉秀梵，張丹俊

（1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州225009；2. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，合肥230031）

2011～2014年安徽省發(fā)病雞群H9亞型禽流感病毒HA基因的遺傳進(jìn)化分析

胡曉苗1，胡順林1，陳鴻志1，劉 東1，戴 銀2，沈?qū)W懷2，劉秀梵1，張丹俊2

（1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州225009；2. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，合肥230031）

為了解安徽省發(fā)病雞群H9N2亞型禽流感病毒（Avian infl uenza virus， AIV）的變異情況，本研究對(duì)2011～2014年安徽省發(fā)病雞群的368份組織樣品進(jìn)行AIV的雞胚分離和RT-PCR檢測，分離鑒定到17株H9N2 AIV。對(duì)這17株進(jìn)行HA基因測序及系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明：17株HA基因核苷酸序列的相似性為88.5%～99.6%，屬于A/Duck/HongKong/Y280/1997病毒亞系。氨基酸比對(duì)分析顯示，裂解位點(diǎn)326～329位氨基酸為典型的低致病性AIV特征性序列。與A/Chicken/ Shanghai/F/98疫苗株相比，17株HA蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)的226位均為亮氨酸（L），呈現(xiàn)了人流感受體結(jié)合特性；5株200位的點(diǎn)突變（T→I），導(dǎo)致了200位潛在糖基化位點(diǎn)的缺失?？梢姲不帐》蛛x的H9N2 AIV大部分毒株基因序列已發(fā)生變異，目前使用的疫苗能否為禽群提供足夠的保護(hù)力還需要作進(jìn)一步的研究。

禽流感；H9N2亞型；HA基因；遺傳進(jìn)化；雞

H9N2禽流感病毒（Avian influenza virus， AIV）為低致病性禽流感病毒（lowly pathogenic Avian influenza virus，LPAIV），可引起家禽呼吸困難、腹瀉、產(chǎn)蛋下降等癥狀，當(dāng)繼發(fā)細(xì)菌感染時(shí)可引起較高的死亡率。HA蛋白由HA基因編碼，作為囊膜表面的糖蛋白，能夠識(shí)別并結(jié)合宿主唾液酸的細(xì)胞受體，在病毒的感染和復(fù)制過程中發(fā)揮著重要的作用，是流感病毒主要表面抗原和保護(hù)性抗原。HA的裂解位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、受體結(jié)合位點(diǎn)等關(guān)鍵性氨基酸的突變是病毒抗原性和致病性變異的分子基礎(chǔ)之一［1-5］。自1994年我國首次報(bào)道從雞群中分離到H9N2 AIV以來［6］，該病毒已在我國廣泛分布和流行。在混合、繼發(fā)感染其他疾病或不良的飼養(yǎng)條件下，H9N2 AIV可導(dǎo)致高發(fā)病率和死亡率。例如在安徽省特別是在冬季，肉仔雞由于保溫需要禽舍密閉，通風(fēng)不良，AIV感染常常引起支氣管栓塞而導(dǎo)致高發(fā)病率和死亡率。同時(shí)，AIV在廣泛的疫苗選擇壓力之下，經(jīng)過長時(shí)間的演化，容易出現(xiàn)一些變異群的毒株。分析H9N2 AIV的流行和抗原變異情況，了解實(shí)際生產(chǎn)中疾病發(fā)生的原因，可以為安徽省禽流感H9亞型的防控提供預(yù)警報(bào)告和決策依據(jù)，同時(shí)為新型疫苗的研制提供材料和方向，為篩選出候選疫苗株進(jìn)行新疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疑似禽流感病料 2012～2014年采自安徽省臨床疑似發(fā)生禽流感的雞群。

1.1.2 試劑 RNA提取試劑Trizol Reagent購自Invitrogen公司；RNA 酶抑制（RRI）、反轉(zhuǎn)錄酶及Taq DNA聚合酶等購自大連TAKARA公司；DNA回收試劑盒（DNA Gel Extraction Kit）購自Axygen 公司；新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）陽性血清、禽流感血凝素分型血清（H5、H9）由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 雞胚和引物 SPF種蛋購自山東省家禽研究所SPF種雞場，在本實(shí)驗(yàn)室孵化至9～11日齡備用。反轉(zhuǎn)錄引物為1 2堿基隨機(jī)引物：5'-AGCAAAAGCAGG-3'。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分離與鑒定 雞胚分離病毒方法按照文獻(xiàn)［7］中方法處理，臨床病料樣品在無菌條件下研磨，并用雙抗PBS配制成10%的組織勻漿，1000×g離心5 min后，直接取上清接種10日齡SPF雞胚尿囊腔。收集的尿囊液用NDV陽性血清、AI血凝素分型血清（H5、H9）進(jìn)行HI實(shí)驗(yàn)，確定病毒的HA亞型。對(duì)于無法用HI試驗(yàn)鑒定出的血凝試驗(yàn)陽性樣品采用RT-PCR方法鑒定，具體引物和PCR條件參照文獻(xiàn)［8］中方法進(jìn)行。

1.2.2 病毒RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 用Trizol裂解法提取RNA，步驟參照Trizol試劑說明書。反轉(zhuǎn)錄：用含12堿基隨機(jī)引物的DEPC水（稀釋好的隨機(jī)引物3 μL、DEPC水32 μL、共35 μL）溶解提取出來的病毒RNA，置60℃水浴10 min后冰浴5 min，加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（10 μL 10×RT buffer、3 μL dNTP、1 μL反轉(zhuǎn)錄酶，1 μL RNA酶抑制劑，共15 μL），置42℃水浴反轉(zhuǎn)錄1.5 h后取出，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT-PCR擴(kuò)增病毒HA基因 在GenBank中查找到H9N2 AIV相應(yīng)基因片段的參考核苷酸序列，采用P r i m e r v 5.0設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程公司合成。H9 HA-F：5′-AGCAAAAG CAGGGG-3′，HA-R：5′-AGTAGAAACAAGG GTGTTTT-3′；H9 HA-M-F：5′-CTYCACACA GARCACAATGG-3′，H9 HA-M-R：5′-GTCACA CTTGTTGTTGTRTC -3′。參照文獻(xiàn)［9］采用PCR分段擴(kuò)增病毒基因片段，HA基因片段約1700 bp，分段擴(kuò)增的片段為1200 bp和600 bp。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的回收、純化和測序 PCR 產(chǎn)物按DNA回收試劑盒說明書進(jìn)行，送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.2.5 基因序列拼接、比對(duì)及遺傳進(jìn)化分析 采用DNAStar 4.0版本中的EditSeq、MegAlign來進(jìn)行序列拼接和比對(duì)；使用BLAST程序搜索出核苷酸序列和氨基酸序列的同源率，用MEGA5分析軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的繪制和遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 HA基因擴(kuò)增結(jié)果 17個(gè)毒株HA基因開放閱讀框（open reading frame， ORF）全長均為1683 bp，共編碼560個(gè)氨基酸，包含18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽部分、321個(gè)氨基酸的HA1部分和221個(gè)氨基酸的HA2部分，與H9亞型禽流感病毒華東地區(qū)經(jīng)典株A/ Chicken/Shanghai/F/98相比，無任何核苷酸的插入和缺失。

2.2 HA基因核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸同源性分析 17個(gè)毒株HA基因核苷酸序列的相似性為88.5%～99.6%，氨基酸序列相似性在82.0%～99.6%。17個(gè)毒株與香港地區(qū)分離到的經(jīng)典毒株A/Duck/Hongkong/ Y280/97（Dk/HK/Y280/97）以及安徽省經(jīng)典疫苗株A/Chicken/Shanghai/F/98（Ck/SH/F/98）HA基因序列的同源性結(jié)果表明，17個(gè)毒株與DK/HK/Y280/97的HA基因核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列相似性分別在85.4%～86.5%和87.7%～88.6%，而和Ck/SH/F/98的核苷酸及氨基酸序列相似性分別為90.3%～91.3%和91.6%～93.9%。

圖1 H9N2禽流感病毒HA基因遺傳樹Fig.1 Phylogenetic tree for HA gene of H9N2 Avian infl uenza virus

2.3 HA基因遺傳進(jìn)化分析 根據(jù)HA基因編碼區(qū)序列繪制HA基因遺傳進(jìn)化樹（圖1）。從遺傳進(jìn)化樹可以看出，本研究中17個(gè)分離株的HA基因基本屬于Dk/HK/Y280/97-like但又與Dk/HK/Y280/97，特別是與疫苗株Ck/SH/F/98株具有一定的差異。此遺傳進(jìn)化分析結(jié)果與HA基因相似性分析結(jié)果是一致的，說明在2011～2014年期間，華東地區(qū)的H9N2 AIV在同源疫苗的免疫選擇壓下，其HA基因發(fā)生了較大的遺傳漂變。

2.4 HA氨基酸變異分析 17個(gè)毒株HA裂解位點(diǎn)326～329位氨基酸中16株為RSSR，其中1株發(fā)生了變化，為PYSR（15株P(guān)SRSSR，1株為PSRYSR，1株為PARSSR）。其中16株均僅有2個(gè)不連續(xù)的堿性氨基酸，為典型的低致病性禽流感病毒特征性序列，與DK/Y280/97株裂解位點(diǎn)（PARSSR）相比324位發(fā)生A→S的變異。17個(gè)毒株中5株（CK/AH/1223/2012、CK/AH/0301/2015、CK/AH/0305/2015、CK/AH/525/2014、CK/ AH/525/2014）HA部分202位T→I的變化，導(dǎo)致200位糖基化位點(diǎn)逐漸缺失（表1）。與DK/HK/Y280/97相比較大部分毒株受體結(jié)合位點(diǎn)的180位發(fā)生T→A/ V變異，其余位點(diǎn)均高度保守（表2）。226位氨基酸與唾液酸受體NeuAc2， 6 Gal和NeuAc2， 3 Gal的結(jié)合特性有關(guān)，早期H9N2 AIV的226位氨基酸大多為Gln（Q），本研究中所有H9N2 AIV的226位氨基酸均為Leu（L）（表2），與人流感病毒的一致［10］。這表明該地區(qū)流行的H9N2 AIVs具有與NeuAc2， 6 Gal受體結(jié)合的可能，對(duì)哺乳動(dòng)物（包括人）的致病可能大大增加。17株H9N2毒株的228位氨基酸均為Gly（G），與人流感病毒的Ser不同，與Ck/ SH/F/98株相同。與DK/HK/Y280/97相比，17株毒株中的絕大部分受體結(jié)合區(qū)袋狀結(jié)構(gòu)的左側(cè)壁氨基酸序列發(fā)生了變異，由NGLQQR變?yōu)镹GLMGR/ NGLQGR，而右側(cè)壁的氨基酸序列保守，沒有發(fā)生變異（表2）。

表1 H9N2亞型禽流感潛在糖基化位點(diǎn)Table 1 Potential N-glycosylation sites （PGS） of H9N2 subtype AIV isolates

表2 H9N2亞型禽流感袋狀結(jié)合區(qū)和裂解位點(diǎn)Table2 Receptor-binding pocket and cleavage site of H9N2 subtype AIV isolates

3 討論

3.1 分離毒株所處的分類分析 本研究對(duì)2011～2014年分離自安徽省的H9N2 AIV進(jìn)行了HA基因的遺傳進(jìn)化分析。17個(gè)毒株與經(jīng)典毒株Dk/HK/Y280/97的HA基因核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列相比性分別在85.4%～86.5%和87.7%～88.6%，與安徽省經(jīng)典疫苗株Ck/SH/F/98的HA核苷酸及氨基酸序列相比性也只有90.3%～91.3%和91.6%～93.9%。說明本研究分離的17個(gè)毒株HA基因與Ck/SH/F/98、Dk/HK/Y280/97之間的相似性并不算太高，嚴(yán)格說來不應(yīng)劃為同一亞系，但目前沒有其他廣為認(rèn)可的新的經(jīng)典株作為劃分依據(jù)，只能暫時(shí)按此劃分。17個(gè)分離株HA基因與疫苗株Ck/SH/F/98株進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，說明在2011～2014年期間，安徽省的H9N2 AIV雖然未發(fā)生大的遺傳變異，但是與疫苗株出現(xiàn)一定的差異，所以目前使用的疫苗能否給禽群提供足夠的保護(hù)力還需要作進(jìn)一步的研究。

3.2 分離毒株HA基因變異分析 流感病毒感染細(xì)胞的先決條件為HA在感染過程中被水解成兩條肽鏈，低致病性流感病毒HA蛋白的裂解位點(diǎn)含有1～2個(gè)堿性氨基酸，本研究中16個(gè)毒株該位點(diǎn)都是RSSR，符合低致病禽流感病毒的特征。1個(gè)毒株HA裂解位點(diǎn)326～329位氨基酸由RSSR變?yōu)镽YSR，與DK/ Y280/97株裂解位點(diǎn)（PARSSR）相比324位發(fā)生A→S的變異，這些變異是否會(huì)引起病毒毒力的相關(guān)變化還有待繼續(xù)監(jiān)測驗(yàn)證。HA蛋白潛在的糖基化位點(diǎn)也是影響禽流感病毒致病力的重要因素，受體結(jié)合位點(diǎn)附近的糖基會(huì)影響病毒和宿主細(xì)胞的結(jié)合水平，裂解位點(diǎn)附近的糖基可能通過干擾蛋白酶進(jìn)入裂解位點(diǎn)影響蛋白酶對(duì)HA前體蛋白的裂解。本研究中5個(gè)毒株202位T→I的變化導(dǎo)致200位糖基化位點(diǎn)逐漸缺失，該糖基化位點(diǎn)的缺失是否會(huì)增強(qiáng)病毒的毒力還有待后續(xù)研究證實(shí)。

［1］Bosch F X， Garten W， Klenk H D. Proteolytic cleavage of influenza virus hemagglutinins∶ primary structure of the connecting peptide between HA1 and HA2 determines proteolytic cleavability and pathogenicity of avian influenza viruses［J］. Virology， 1981， 113（3）∶ 725-735.

［2］Graaf D M， Fouchier R A. Role of receptor binding specificity in influenza A virus transmission and pathogenesis［J］. EMBO J， 2014， 33（8）∶ 823-841.

［3］Wan H， Perez D R. Amino Acid 226 in the Hemagglutinin of H9N2 Influenza viruses determines cell tropism and replication in human airway epithelial Cells［J］. J Virol，2007， 81（10）∶ 5181-5191.

［4］Arnold J N， Wormald M R， Sim R B， et al. The impact of glycosylation on the biological function and structure of human immunoglobulins［J］. Annu Rev Immunol， 2007，25∶ 21-50.

［5］Harvey R， Martin A C R， Zambon M， et al. Restrixtions to the adaption of influenza A virus H5 hemagglutinin to the human host［J］. J Virol， 2004， 78（1）∶ 502-507.

［6］陳伯倫， 張澤紀(jì). 禽流感研究I∶ 雞A 型禽流感病毒的離與血清學(xué)初步鑒定［J］.中國獸醫(yī)雜志， 1994， 22（10）∶ 3-5.

［7］Webster R G， Krauss S. WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance［Z］. 2002.

［8］Qiu B F， Liu W J， Peng D X， et al. A reverse transcription- PCR for subtyping of theneuraminidase of avian influenza viruses ［J］. J Virol Methods， 2009， 55（2）∶193-198.

［9］張?jiān)u滸， 劉曉文， 錢忠明， 等. 水禽流感病毒分離株A/ Duck/Yangzhou/233/02（H6N2）膜蛋白基因遺傳進(jìn)化分析［J］. 微生物學(xué)報(bào)， 2005， 45（4）∶ 491-495.

［10］Slomka M， Hanna A， Mahmood S， et al. Phylogenetic and molecular characteristics of Eurasian H9 avian influenza viruses and their detection by two different H9-specific RealTime reverse transcriptase polymerase chain reaction tests［J］. Vet Microbiol， 2013， 162（2-4）∶ 530-542.

GENETIC EVOLUTION ANALYSIS OF HEMAGGLUTININ GENE OF H9 SUBTYPE AVIAN INFLUENZA VIRUS ISOLATED FROM DISEASED CHICKEN IN ANHUI PROVINCE FROM 2011 TO 2014

HU Xiao-miao1， HU Shun-lin1， CHEN Hong-zhi1， LIU Dong1， DAI Yin2， SHEN Xue-huai2，LIU Xiu-fan1， ZHANG Dan-jun2
（1. Key Laboratory of Animal Infectious Diseases， Ministry of Agriculture， College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China； 2. Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei 230031， China）

A total of 368 diseased chicken samples were collected from 2011 to 2014 in Anhui Province and detected in RT-PCR for surveillance of H9N2 subtype Avian infl uenza virus （AIV）. As a results， 17 samples purifi ed in chicken embryonic eggs were positive for H9N2 subtype AIV and their HA genes were sequenced. The sequence alignment showed that the homology of these HA genes were from 88.5% to 99.6%， belonging to the A/Duck/HongKong/Y280/1997 phylogenetical lineage. The HA cleavage site（326～329aa） of these isolates belonged to the low pathogenicity. As compared with A/Chicken/ Shanghai/F/98 vaccine strain， aa226 （T→I） in all 17 isolates，which was a characteristic of human infl uenza virus-like receptor specifi city. A single amino acid mutation （T→I） resulted in the deletionof potential glycosylation sites at position 200. These results indicated that most H9N2 subtype AIV isolates from the diseased chicken fl ocks in Anhui Province had experienced genetic variation. Further study is needed to determine whether the currently used vaccines can provide effective protection for chickens.

Avian infl uenza； H9N2 subtype； HA gene； genetic evolution； chicken

S852.659.5

A

1674-6422（2015）05-0021-06

2015-05-05

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-41）；安徽省農(nóng)科院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（11C0404）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31302044）

胡曉苗，男，碩士，助理研究員，主要從事獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)研究

劉秀梵， E-mail：xfliu@yzu.edu.cn；張丹俊， E-mail：zhangdj694@sina.com