典型納米金屬氧化物對氨氧化菌Nitrosomonas europaea的生物脅迫影響

劉美婷，余 冉*，陳良輝，吳俊康（1.東南大學(xué)能源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210096；2.東南大學(xué)無錫太湖水環(huán)境工程研究中心，江蘇 無錫 214135）

典型納米金屬氧化物對氨氧化菌Nitrosomonas europaea的生物脅迫影響

劉美婷1，2，余 冉1，2*，陳良輝1，2，吳俊康1，2（1.東南大學(xué)能源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210096；2.東南大學(xué)無錫太湖水環(huán)境工程研究中心，江蘇 無錫 214135）

對比研究了3種典型納米金屬氧化物顆粒（NPs，包括納米TiO2（n-TiO2），納米CeO2（n-CeO2）和納米ZnO（n-ZnO））在不同作用濃度下（0，0.1，1，10，50mg/L）對污水生物脫氮系統(tǒng)中代表性氨氧化菌— Nitrosomonas europaea連續(xù)作用6h的毒性效應(yīng)及作用規(guī)律.結(jié)果表明，3種NPs對N.europaea的生物脅迫效應(yīng)與其投加濃度均呈正相關(guān).其中，50mg/L的n-CeO2， n-ZnO與對照組相比，可顯著降低N.europaea細(xì)菌濃度，破壞細(xì)胞膜完整性，抑制氨氧化速率.相同濃度條件下， n-ZnO對N.europaea的毒性影響最大， n-TiO2影響最小.雖然n-ZnO釋放的Zn2+對N.europaea具有明顯的毒性效應(yīng)，但n-ZnO及其產(chǎn)生的尺寸效應(yīng)仍是其生物脅迫產(chǎn)生的重要來源.

納米顆粒；氨氧化菌；生物毒性

納米顆粒（NPs）由于其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、催化、食品、化妝品、環(huán)境污染治理等領(lǐng)域［1］.但NPs獨(dú)特的小尺寸效應(yīng)與高表面活性使其易產(chǎn)生與常規(guī)尺寸物質(zhì)不同的毒性效應(yīng)或?qū)е露拘孕?yīng)放大［2］.NPs的生物安全性已受到越來越廣泛的關(guān)注［3-4］.

NPs的大量使用導(dǎo)致其在生產(chǎn)、使用、處置過程中不可避免地通過污水收集管網(wǎng)進(jìn)入市政污水處理廠［5-6］，歐洲地區(qū)水環(huán)境中n-ZnO濃度可達(dá)到0.432mg/L，美國10處代表性污水處理廠進(jìn)水中n-TiO2濃度范圍為181～1233μg/L［7］. NPs進(jìn)入污水處理廠會對污水處理系統(tǒng)產(chǎn)生潛在威脅. 50mg/L納米TiO2（n-TiO2）進(jìn)入序批式生物反應(yīng)器會顯著降低總氮去除效率、改變活性污泥生物種群結(jié)構(gòu)并降低其生物多樣性［8］；1mg/L納米ZnO（n-ZnO）和納米Ag沖擊負(fù)荷均對生物硝化反應(yīng)活性具有抑制作用［4，9］.但迄今為止，針對納米污染物對污水脫氮工藝限速步驟—氨氧化過程的影響研究還較少，對在氨氧化過程中起關(guān)鍵作用的微生物菌團(tuán)毒性作用及其影響機(jī)理仍缺乏系統(tǒng)性研究［5，9］.因此，本文選取3種已被廣泛應(yīng)用，并且已證實(shí)存在于污水處理系統(tǒng)中的納米金屬氧化物—即n-TiO2、納米CeO2（n-CeO2）、n-ZnO為研究對象， 以污水生物脫氮系統(tǒng)中典型又廣泛存在的氨氧化菌—?dú)W洲亞硝化單胞菌（Nitrosomonas europaea）作為受試對象，考察具有不同化學(xué)組成、帶電性、與溶解度等特性的NPs對N.europaea在生理生化水平上的短期作用影響，研究其毒性作用規(guī)作用規(guī)律，對比不同NPs生物脅迫效應(yīng)的差異，并探討其相關(guān)影響機(jī)理， 為進(jìn)一步研究NPs對污水脫氮處理工藝的作用影響與作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 NPs與表征

n-TiO2、n-CeO2、n-ZnO購自美國Sigma公司，純度＞99.7%.利用掃描電子顯微鏡（JSW-7600F，日本電子株式會社）觀察粉狀NPs的形態(tài).利用馬爾文納米激光粒度儀（Zetasizer Nano ZS90，英國Malvern公司）檢測經(jīng)超聲（17w，20min）處理、溶于超純水的NPs 動態(tài)光散射粒徑及Zeta電位.

1.2 N.europaea細(xì)胞培養(yǎng)

將N.europaea（ATCC19718）菌種（由中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所于昌平教授課題組提供）置于穩(wěn)定運(yùn)行的恒流生物反應(yīng)器中培養(yǎng)（28℃、pH（7.45±0.02）、水力停留時間2.2d、溶解氧濃度（1.80±0.10）mg/L），培養(yǎng)液配制參考Fang等［10］研究.進(jìn)水氨氮）設(shè)計(jì)濃度為280mg/L.

1.3 NPs對N.europaea短期暴露試驗(yàn)

取恒流生物反應(yīng)器穩(wěn)定生長的N.europaea菌液各300mL，分別投加經(jīng)高溫滅菌及超聲分散均勻的n-TiO2、n-CeO2或n-ZnO至NPs最終濃度分別為0（對照組），0.1，1，10，50mg/L.同時投加經(jīng)高溫滅菌的（NH4）2SO4溶液至最終投加濃度為50mg/L.針對n-ZnO溶解度高的特點(diǎn)，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)測定50mg/L n-ZnO對N.europaea作用6h后釋放的Zn2+濃度為（3.4±0.2）mg/L，故另取300mL菌液，投加ZnSO4至Zn2+最終濃度為3.4mg/L作為Zn離子毒性作用對比組.菌液與NPs在28℃、120r/min的水浴恒溫振蕩器內(nèi)避光混合培養(yǎng)6h后取樣分析.

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.2.5 Western blot檢測移植瘤組織中PCNA、survivin、CDK4、p21蛋白表達(dá) 取1.2.4中收集的腫瘤組織，檢測組織中PCNA、survivin、CDK4、p21蛋白表達(dá)水平，以Western blot方法檢測，步驟同1.2.3。

N.europaea菌種與NPs混合液DLS粒徑、Zeta電位采用馬爾文納米激光粒度儀測定.細(xì)菌濃度采用直接計(jì)數(shù)法于顯微鏡（OLYMPUSBX41，日本OLYMPUS公司）下計(jì)數(shù)獲得.選用LIVE/DEAD?BaclightTWBacterial Viability熒光染料（美國Life technologies公司）測定N.europaea細(xì)胞膜受損狀況.氨氮濃度測定選用水楊酸-次氯酸鹽光度法，亞硝態(tài)氮濃度測定選用N-（1-萘基）-乙二胺光度法.Zn2+測定選用火焰原子吸收分光光度法.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每一設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行了平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，每一樣品的各項(xiàng)指標(biāo)均平行測定2次.文中試驗(yàn)結(jié)果均以2次重復(fù)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS Statistics統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行T檢驗(yàn)差異性分析，當(dāng)P＜0.05時表示有顯著性差異.

2 結(jié)果

2.1 NPs表征

經(jīng)SEM掃描分析顯示（圖1），n-TiO2、n-CeO2近似球狀、大小較均勻， n-ZnO粒子形態(tài)呈不規(guī)則方形、粒徑較不均勻.通過在電鏡不同視野下各隨機(jī)選取200個顆粒進(jìn)行粒徑的人工測定與統(tǒng)計(jì)，得到n-TiO2、n-CeO2平均粒徑分別為（41±10）nm和（35±11）nm， n-ZnO長度方向平均粒徑為（95±24）nm.考慮到NPs顆粒間的團(tuán)聚作用及外界介質(zhì)對顆粒的可能影響，本文利用動態(tài)光散射技術(shù)測定n-TiO2、n-CeO2、n-ZnO在超純水中的DLS粒徑分別為（187±69）nm、（509± 119）nm和（285±43）nm. Zeta電位檢測顯示n-TiO2、n-CeO2、n-ZnO在水中分別呈負(fù)電性［（-26.7±11.1） mV］、弱負(fù)電性［（-6.4±3.6） mV］、和正電性［（16.2±2.91） mV］.

2.2 NPs對菌液粒徑的影響

圖2顯示了NPs與N.eureopaea菌液混合作用后混合液顆粒粒徑的變化規(guī)律.與純菌液對照組相比，混合液顆粒平均粒徑均與NPs濃度呈正相關(guān)性增大.50mg/L n-TiO2、n-ZnO、n-CeO2的加入分別導(dǎo)致混合液粒徑與純菌液相比顯著增大了（69.7±15.7）%、（92.4±18.1）%和（99.4±19.8）%.鑒于對照組中N.europaea細(xì)胞直徑為（828.2± 83.6）nm，NPs可能吸附于細(xì)菌表面或?qū)е铝思?xì)胞變形.n-CeO2的濃度達(dá)到10mg/L以上時，對混合液粒徑的影響程度略高于其他2種NPs，這可能與n-CeO2本身在溶液中的DLS粒徑較大有關(guān).

圖1 NPs的SEM圖譜Fig.1 SEM images of NPs

2.3 NPs對菌液Zeta電位的影響

圖2 NPs對混合液粒徑的影響Fig.2 Impacts of NPs on the size of particle-cell complex

圖3 NPs對混合液Zeta電位的影響Fig.3 Impacts of NPs on the Zeta potential of particle-cell complex

2.4 NPs對N.europaea細(xì)胞膜的影響

細(xì)胞膜是NPs接觸細(xì)胞的第一道屏障，細(xì)胞膜的受損狀況可以反映出NPs作用于細(xì)胞的早期脅迫影響.圖4顯示， N.europaea細(xì)胞膜未受損細(xì)胞占總細(xì)胞的比例隨3種NPs投加濃度的增大均呈現(xiàn)降低趨勢，其中50mg/L n-TiO2、n-CeO2、n-ZnO以及10mg/L n-ZnO組的細(xì)胞膜未受損細(xì)胞比例明顯低于對照組（P＜0.05），分別降低了（2.8±0.9）%、（4.5±0.9）%、（6.5±0.6）%和（5.4±0.8）%.n-ZnO在各試驗(yàn)作用濃度下對N.europaea細(xì)胞膜的損傷程度均明顯高于其它兩種NPs.n-CeO2對細(xì)胞膜的損傷影響則稍高于n-TiO2. 50mg/L n-ZnO對細(xì)胞膜的損傷程度顯著高于其對應(yīng)Zn2+（3.4mg/L）對細(xì)胞膜的影響程度，其結(jié)果預(yù)示，n-ZnO及其尺寸效應(yīng)可對細(xì)胞細(xì)胞膜產(chǎn)生重要脅迫損傷.

圖4 NPs對N.europaea細(xì)胞膜完整性的影響Fig.4 Impacts of NPs on the membrane integrity of N.europaea

2.5 NPs對N.europaea細(xì)菌濃度的影響

圖5 NPs對細(xì)菌濃度的影響Fig.5 Impacts of NPs on cell density

3種NPs的投加均導(dǎo)致N.europaea細(xì)菌濃度降低，并呈現(xiàn)明顯的劑量—效應(yīng)相關(guān)關(guān)系（圖5）.50mg/L n-TiO2、n-CeO2、n-ZnO以及10mg/L n-ZnO組的細(xì)菌濃度分別較對照組顯著下降了（27.3±12.4）%、（34.1±15.8）%、（48.4±15.4）%和（34.2±14.5）%.n-TiO2和n-CeO2對N.europaea細(xì)菌濃度的影響相近且較小.n-ZnO在各作用濃度下對細(xì)菌濃度的影響最大，在50mg/L濃度條件下，與受相同濃度n-TiO2和n-CeO2影響的細(xì)菌濃度存在顯著差異.受Zn2+影響的細(xì)菌濃度較對照組下降了（39.6±15.9）%，但與50mg/L n-ZnO的結(jié)果無顯著差異.

2.6 NPs對N.europaea氨氧化速率的影響

N.europaea好氧狀態(tài)下在氨單加氧酶（AMO）催化作用下將氨（NH3）氧化為羥胺（NH2OH），同時羥胺在羥胺還原酶（HAO）催化作用下迅速氧化為亞硝酸根［11］.鑒于氨氮在試驗(yàn)不斷攪拌條件下的揮發(fā)影響，本文依據(jù)實(shí)驗(yàn)過程中亞硝態(tài)氮的平均生成速率的測定，分析討論NPs脅迫影響下N.europaea氨氧化速率的變化規(guī)律.

圖6顯示在3種NPs不同濃度作用條件下，N.europaea氨氧化速率隨NPs濃度的增加均呈現(xiàn)持續(xù)降低趨勢.受不同濃度n-TiO2影響的氨氧化速率與對照組相比均無顯著差異，表明n-TiO2在本文試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)短期6h作用于N.europaea對其氨氧化速率影響較小.n-CeO2和n-ZnO在50mg/L濃度時， N.europaea的氨氧化速率明顯減緩，其抑制率分別為 （33.3±6.1）%和（60.0±9.4）%.n-ZnO對細(xì)胞氨氧化速率影響在3種NPs中最大，并呈現(xiàn)顯著的濃度抑制效應(yīng).同時，50mg/L n-ZnO組氨氧化速率顯著低于其對應(yīng)Zn2+試驗(yàn)組，其結(jié)果表明了n-ZnO及其尺寸效應(yīng)在n-ZnO生物毒性作用中的重要地位.

圖6 NPs對氨氧化速率的影響Fig.6 Impacts of NPs on ammonia oxidation rate

3 討論

目前，對NPs毒性機(jī)制的研究主要集中在氧化脅迫和細(xì)胞膜損傷兩方面.研究發(fā)現(xiàn)，n-TiO2和n-ZnO均能穿透細(xì)菌細(xì)胞膜，到達(dá)細(xì)胞內(nèi)部，產(chǎn)生高活性氧分子（ROS），造成細(xì)胞損傷甚至凋亡［12］. n-CeO2毒性機(jī)制研究目前主要集中于真核細(xì)胞，對細(xì)菌等原核生物的研究較少.如n-CeO2能夠誘導(dǎo)與氧化脅迫有關(guān)的基因表達(dá)，導(dǎo)致人正常肺上皮細(xì)胞中ROS 濃度升高、谷胱甘肽活性增高，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡［13］.在本研究中，NPs作用下N.europeae氨氧化速率的抑制與細(xì)菌濃度的降低可能與NPs誘導(dǎo)下細(xì)胞體內(nèi)ROS大量產(chǎn)生密切相關(guān).細(xì)胞膜可以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的代謝環(huán)境，同時調(diào)節(jié)和選擇進(jìn)出細(xì)胞的營養(yǎng)物質(zhì)，是外界接觸細(xì)胞的第一道屏障.很多研究者［10，14-15］都觀察到n-CeO2、n-ZnO等可與細(xì)菌細(xì)胞直接接觸，并改變細(xì)胞膜粘滯性，增加細(xì)胞膜滲透性，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變、NPs在細(xì)胞膜上積累甚至進(jìn)入胞內(nèi)，從而對細(xì)胞造成毒性損傷.本研究發(fā)現(xiàn)，NPs作用下混合液粒徑與Zeta電位的顯著變化也預(yù)示了NPs與細(xì)胞密切接觸.同時高濃度（如50mg/L）n-TiO2、n-CeO2、n-ZnO投加的影響也證實(shí)了NPs可破壞N.europeae細(xì)胞膜完整性.但根據(jù)Fang等［10］研究發(fā)現(xiàn)，納米顆粒與N.europaea短期作用4h后，納米顆粒已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，此時細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變，但并無明顯的細(xì)胞膜破損現(xiàn)象，因此納米顆粒的毒性影響可能會首先體現(xiàn)在細(xì)胞酶活性抑制上從而造成氨氧化速率的降低，甚至影響細(xì)胞的新陳代謝過程從而降低細(xì)胞生長速率.

本研究發(fā)現(xiàn)，n-TiO2、n-CeO2、n-ZnO對N.europeae存在不同程度的生物脅迫影響，表明NPs的毒性還與其本身的物理化學(xué)性質(zhì)存在密切關(guān)系.n-TiO2的作用機(jī)理可能與其小顆粒粒徑及高效光催化活性有關(guān)［16-17］.在本研究的3種NPs中，n-TiO2的DLS粒徑最小，比表面積最大，表面活性也最強(qiáng)，因此可能更易于向細(xì)胞周圍聚集和吸附［17］.n-TiO2的光催化活性，使其在能隙帶能量或其能級以上發(fā)生光激發(fā)現(xiàn)象更容易促進(jìn)ROS的產(chǎn)生，造成氧化脅迫，損傷細(xì)胞［12，18］.因本研究避光進(jìn)行，故可排除n-TiO2光催化活性影響，其6h短期毒性影響在本研究的3種NPs中也最不顯著.n-CeO2的毒性作用可能與其自身的氧化作用有關(guān)，Thill等［14］認(rèn)為n-CeO2可以吸附在大腸桿菌細(xì)胞表面氧化細(xì)胞組分，甚至產(chǎn)生與ROS引起的氧化脅迫不同的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而對細(xì)胞造成損傷.

n-ZnO的表面電荷性及溶解度可能是導(dǎo)致其生物毒性在3種NPs中最高的原因.帶正電荷的n-ZnO和帶負(fù)電荷的N.europeae細(xì)菌間可能產(chǎn)生較強(qiáng)的靜電引力，使其更容易吸附到細(xì)菌表面，直接與細(xì)菌接觸，從而造成對細(xì)胞膜更大程度的損傷［19］.本研究中受n-ZnO作用后，菌液粒徑增加和Zeta電位下降也間接證明了此觀點(diǎn). Feris等［20］研究發(fā)現(xiàn)，可以通過調(diào)整n-ZnO與4種基因型相同、帶電荷不同的銅綠假單胞菌株之間的靜電吸附作用來改變n-ZnO對其產(chǎn)生的毒性作用程度.另外，n-ZnO溶解釋放的Zn2+可能與細(xì)胞膜或胞內(nèi)的蛋白及核酸結(jié)合，從而抑制細(xì)胞正常的新陳代謝，增強(qiáng)n-ZnO的生物毒性.如Frallklin等［21］發(fā)現(xiàn)，n-ZnO對綠藻的毒性主要來源于Zn2+；Li等［19］發(fā)現(xiàn)，n-ZnO對大腸桿菌的毒性作用主要來源于自由態(tài)的Zn2+和不穩(wěn)定的鋅復(fù)合物.本文比較了50mg/L n-ZnO與對應(yīng)其6h溶解度的Zn2+的毒性作用影響發(fā)現(xiàn)，n-ZnO對N. europeae細(xì)胞膜損傷及氨氧化速率抑制程度明顯高于Zn2+實(shí)驗(yàn)組，但兩者對細(xì)菌濃度的影響無顯著差異.因此可以推測在短期毒性試驗(yàn)中，溶解的Zn2+雖可引起n-ZnO毒性脅迫影響，但n-ZnO及其尺寸效應(yīng)也是其生物毒性作用產(chǎn)生的重要原因之一.

本研究的3種NPs在10mg/L以上的濃度條件下，經(jīng)過6h短期作用，均對污水處理系統(tǒng)中典型而普遍存在的N.europeae產(chǎn)生了生物脅迫效應(yīng).鑒于NPs應(yīng)用的日趨廣泛性及在反應(yīng)器內(nèi)的長期累積潛在影響， NPs對生物除氮工藝的作用規(guī)律與影響機(jī)制需要更深入與系統(tǒng)的研究.

4 結(jié)論

NPs的6h短期作用即可對N.europeae產(chǎn)生明顯生物脅迫影響，其投加濃度與毒性效應(yīng)呈正相關(guān)性.相同NPs作用濃度下，n-ZnO對N.europaea的毒性影響最大， n-TiO2影響最小.鑒于50mg/L n-ZnO對細(xì)胞膜損傷及氨氧化抑制程度明顯高于其對應(yīng)溶解度下Zn2+在相同作用條件下對細(xì)胞的毒性影響，故推測n-ZnO本身及其產(chǎn)生的尺寸效應(yīng)仍是n-ZnO的主要作用機(jī)制來源.

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Biological effects of typical metal oxide nanoparticles on Nitrosomonas europaea.

LIU Mei-ting1，2， YU Ran1，2*， CHEN Liang-hui1，2， WU Jun-kang1，2（1.School of Energy and Environment， Southeast University， Nanjing 210096， China；2.Wuxi Engineering Research Center of Taihu Lake Water Environment， Southeast University， Wuxi 214135， China）. China Environmental Science， 2015，35（1）：190～195

The biotoxicities and impact patterns of three widely used nanoparticles （NPs） TiO2， CeO2and ZnO （n-TiO2，n-CeO2and n-ZnO） on the typical ammonia oxidizing bacteria， Nitrosomonas europaea were investigated. N.europaea was exposed to the NPs at a series of concentrations （0， 0.1， 1， 10， 50mg/L） for 6h. The effects of NPs on N.europaea were positively correlated with the exposed NP concentrations and the 50mg/L n-CeO2and n-ZnO significantly impaired the cell membrane integrity， cell density， and ammonia oxidization rate. n-ZnO showed the highest biotoxicity among the three NPs while n-TiO2showed the least. n-ZnO with its nano-size was considered to induce the serious nanotoxicities on N.europaea although the Zn2+dissolved from n-ZnO also contributed to n-ZnO toxicty.

nanoparticles；ammonia oxidizing bacterium；biotoxicity

X503.2

A

1000-6923（2015）01-0190-06

劉美婷（1989-），女，山東濟(jì)南人，東南大學(xué)能源與環(huán)境學(xué)院碩士研究生，主要從事水污染控制研究.

2014-05-03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（51208092）；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（BK2012124）；國家教育部博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目（20120092120010）

* 責(zé)任作者， 副教授， yuran@seu.edu.cn