同步硝化反硝化系統(tǒng)中反硝化細菌多樣性研究

鄭林雪，李 軍*，胡家瑋，侯愛月，卞 偉，鄭照明（北京工業(yè)大學水質(zhì)科學與水環(huán)境恢復工程北京市重點實驗室，北京 0024）

同步硝化反硝化系統(tǒng)中反硝化細菌多樣性研究

鄭林雪1，李 軍1*，胡家瑋1，侯愛月1，卞 偉1，鄭照明1（北京工業(yè)大學水質(zhì)科學與水環(huán)境恢復工程北京市重點實驗室，北京 100124）

采用聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）和分子克隆構(gòu)建nirS克隆文庫對同步硝化反硝化系統(tǒng)好氧池中反硝化細菌多樣性進行了研究.從克隆文庫中隨機挑選75個克隆子進行序列測定，對測序結(jié)果進行了BLAST比對.結(jié)果表明，有74個克隆子分屬于3個不同的細菌類群，包括β-Proteobacteria、γ-Proteobacteria和Uncultured bacterium. β-Proteobacteria綱為好氧池內(nèi)優(yōu)勢菌群，占文庫比例的54.41%；其次是γ-Proteobacteria綱，占文庫比例的25%.對測序得到的12個OTU用MEGA軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示Thauera屬為該系統(tǒng)中最主要的脫氮菌屬.

同步硝化反硝化；反硝化細菌；nirS克隆文庫；細菌多樣性

傳統(tǒng)的生物脫氮技術(shù)包括硝化和反硝化兩個階段，由于硝化菌好氧而反硝化菌厭氧，故傳統(tǒng)理論認為硝化與反硝化過程不可能在同一反應(yīng)器同時進行.然而，近幾年國內(nèi)外不少研究證明有同步硝化反硝化現(xiàn)象（SND），尤其是有氧條件下的反硝化現(xiàn)象確實存在于各種不同的生物處理系統(tǒng)中［1-2］.這些發(fā)現(xiàn)突破了傳統(tǒng)理論，提出好氧反硝化和異養(yǎng)硝化的概念［3］，奠定了SND生物脫氮理論的基礎(chǔ).目前，國內(nèi)外學者對同步硝化反硝化氮的機理尚未完全深入了解，被普遍接受的理論為:宏觀環(huán)境理論；微環(huán)境理論；微生物理論［4］.事實上，同步硝化反硝化現(xiàn)象往往是以上幾種機理共同作用的結(jié)果，實際過程中有可能由一種或幾種作用占優(yōu)勢.關(guān)于同步硝化反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)的研究尚處于初級階段，尤其是在好氧條件下的反硝化菌落結(jié)構(gòu)研究鮮見報道.

1 材料與方法

1.1 試驗裝置與樣品

1.1.1 反應(yīng)器 研究采用連續(xù)流A/O琉璃反應(yīng)器，裝置如圖1所示.反應(yīng)器有效容積為135L，用隔板等分為5個格室，前面1個格室為缺氧區(qū)，后面4個格室為好氧區(qū).有效停留時間HRT為12.5h，內(nèi)回流比為150%，水溫控制26.2～32.1℃，溶解氧控制在1.73～2.42mg/L之間.采用砂頭曝氣，轉(zhuǎn)子流量計控制.反應(yīng)器內(nèi)填充流離填料.

圖1 A/O琉璃反應(yīng)器示意Fig.1 Schematic of the A/O coloured glaze reactor

1.1.2 樣品采集 試驗原水來自北京工業(yè)大學生活污水，水質(zhì)指標如表1所示.A/O流離反應(yīng)器經(jīng)116d的連續(xù)運行，COD、NH4+-N、TN等均獲得了穩(wěn)定的去除效果，污泥取樣時工藝的運行結(jié)果如表2所示，取前端好氧池流離填料表面生物膜污泥（經(jīng)超聲波震蕩使污泥脫落）作為污泥樣品，樣品在-20℃條件下保存.

1.1.3 試劑和儀器設(shè)備 超凈工作臺（VS-1300L-U，蘇凈安泰），全自動滅菌鍋（MLS-3750型，合肥華泰），超純水儀（century， Milli-Q，Millipore），高速離心機（1-14ED，SIGAMA），PCR擴增儀（MyiQ Real-time，Bio-Rad），水平電泳槽（DYCP-31D，北京市六一儀器廠），凝膠成像系統(tǒng)（Gel DocTMXR+，Bio-Rad），DGGE系統(tǒng)（DCodeTM，Bio-Rad），-20℃低溫冰箱（海爾），漩渦混合器（QL-901，Votex），分析天平（AUY220，島津），紫外儀（WB-9403B，北京市六一儀器廠）.

表1 城市污水水質(zhì)特征（mg/L）Table 1 the feature of urban sewage（mg/L）

表2 A/O琉璃反應(yīng)器運行結(jié)果Table 2 The influent and effluent of the A/O coloured glaze reactor

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 泥樣采集好后，用超純水補充至40mL處，15000r/min高速離心5min，棄上清，重復4～5次，取0.1～0.3g污泥于滅菌離心管中，加入400μL 65℃預熱的Buffer SCL，震蕩混勻，置于65℃水浴5min；12000r/min室溫離心3min，吸取上清至1.5mL的離心管中；加入等體積Buffer SP，顛倒混勻，冰浴10min； 12000r/min室溫離心3min，吸取上清至1.5mL的離心管中；加入200μL氯仿，充分混勻，12000r/min離心5min，吸取上層水相至1.5mL的離心管中；加入1.5倍體積的Buffer SB，充分混勻后用移液器將其全部加入到吸附柱中，室溫靜置2min.12000r/min離心30s，倒掉收集管中廢液；將吸附柱放回收集管中，加入700μL Wash Solution，12000r/min離心30s，倒掉收集管中廢液；將吸附柱放回收集管中，加入300μL清洗劑Wash Solution，12000r/min離心1min，倒掉收集管中廢液；將吸附柱放回收集管中，12000r/min離心2min；取出吸附柱，放入1.5mL離心管中，在吸附膜中央加入50～100μL TE Buffer，靜置3min，12000r/min離心2min，得到的DNA溶液置于-20℃保存或直接用于后續(xù)試驗.

1.2.2 PCR擴增 以上一步粗提的DNA為模板，采用反硝化菌特異性引物對nirS1F（5′-CCTA（C/T）TGGCCGCC（A/G）CA（A/G）T-3′）和nirS6R（5′-CGTTGAACTT（A/G）CCGGT-3）′進行PCR擴增.PCR反應(yīng)體系（50μL）為:10×PCR buffer 5μL，dNTP（各2.5mmol/L）1μL，nirS1F （20μmol/L）1μL，nirS6R（20μmol/L）1μL，Taq DNA聚合酶（5U）0.5μL，DNA模板0.5μL，加ddH20至50μL. PCR采用降落式擴增程序，具體反應(yīng)條件為:首先95℃預變性1.5min；其次進行5個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性0.5min，65℃退火0.5min，72℃延伸2min，之后進行5個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性0.5min，55℃退火0.5min，72℃延伸2min，之后再進行15個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性0.5min，50℃退火0.5min，72℃延伸2min；最后60℃延伸10min.

1.2.3 反硝化nirS克隆、轉(zhuǎn)化和文庫的構(gòu)建將得到的PCR產(chǎn)物用上海生工的SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒進行純化后，與pMD18-T載體連接，將連接液混合均勻，16℃反應(yīng)4h.之后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞中，涂布在含Amp/X-Gal/IPTG的LB平板上，37℃下培養(yǎng)12～16h后進行藍白斑篩選.藍色菌落為陰性菌落，白色菌落為陽性菌落，篩選具有氨芐青霉素抗性的白色轉(zhuǎn)化子構(gòu)建16S rDNA克隆文庫.然后以陽性克隆子的PCR產(chǎn)物為模板，用載體通用引物M13-47（5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′）和RV-M（5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′）做菌落PCR進行假陽性的驗證，所插入片段大小約為890bp.片段大小正確的PCR產(chǎn)物用Hha I （Takara， Japan）限制性內(nèi)切酶分型，酶切反應(yīng)于37℃反應(yīng)4h.每個酶切類型挑取1個代表菌株送往上海生工生物公司進行測序.

1.2.4 克隆文庫多樣性分析 將測序所得序列利用NCBI網(wǎng)站上BLAST程序與GenBank中已登錄的序列進行同源性比較，下載具有代表性的同源性較高的序列，并利用MEGA4.0軟件中的鄰接算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取和PCR擴增結(jié)果

用于構(gòu)建反硝化細菌nirS克隆文庫的樣品取自前端好氧池，對流離填料經(jīng)超聲波震動下的污泥樣品提取的DNA進行電泳檢測，得到的總DNA片段大小約為23kb，以其為模板用反硝化細菌nirS基因特異性引物擴增所產(chǎn)生的DNA片段大小約為890bp，是應(yīng)得到的片段大小，滿足后續(xù)實驗要求.

2.2 反硝化細菌nirS克隆文庫

只有當文庫的庫容大到足以檢出群落中主要的成員時，文庫之間的比較才有意義.以覆蓋率C評估所建文庫對細菌多樣性的體現(xiàn)程度:

式中:N為文庫中克隆總數(shù)量；n為單克隆OTU的數(shù)量［12］.本實驗中，N=68，n=2，覆蓋率為97.1%，表明該克隆文庫能較全面地反應(yīng)同步硝化反硝化系統(tǒng)中反硝化細菌種群多樣性.

在構(gòu)建的反硝化菌nirS克隆文庫中，在LB固體培養(yǎng)基上，挑取75個白斑進行菌落PCR篩選陽性克隆，結(jié)果得到74個陽性克隆子.

在構(gòu)建同步硝化反硝化系統(tǒng)中好氧池反硝化細菌克隆文庫時，對隨機挑取樣品的74個陽性克隆采用限制性內(nèi)切酶Hha I酶切，共得到13個酶切類型.

每個酶切類型挑取1個代表克隆子進行測序，測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，將序列比對結(jié)果相同的克隆子定義為一個操作分類單元（OTU）.前端好氧池樣品共得到13個OTU，樣品中主要OTU所含克隆子數(shù)目及其相似性菌株如表3所示.由表3可見，此克隆文庫的細菌與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知細菌的相似性范圍為79%～100%.雖然有2個基因型（OTU2和OTU10）與可培養(yǎng)反硝化菌nirS基因的同源性較高，但是大部分的克隆都與已報道的基因序列親緣關(guān)系較遠，并且相當一部分都與未培養(yǎng)的反硝化菌相似，表明這些反硝化菌可能在分類學上屬于新種.12個OTU分屬于3個主要類群，包括β-Proteobacteria（β-變形菌）、γ-Proteobacteria（γ-變形菌）和Uncultured bacterium（未培養(yǎng)細菌）.其中β-Proteobacteria在克隆文庫中所占的比例為54.41%，為樣品中的優(yōu)勢種群.其次是γ-Proteobacteria，所占文庫比例為25%.此外還有相當一部分未培養(yǎng)的環(huán)境樣品.這與以往的研究結(jié)果一致，即絕大多數(shù)被確認的反硝化菌集中分布于Proteobacteria門［13］，α-Proteobacteria綱、β-Proteobacteria綱和γ-Proteobacteria綱均包含反硝化菌［14］.

表3 同步硝化反硝化系統(tǒng)反硝化細菌nirS克隆文庫分析結(jié)果Table 3 Date of denitrifying bacteria nirS clone library in Simultaneous nitrification and denitrification system

變形門中的β-變形菌和γ-變形菌多為兼具呼吸/發(fā)酵代謝方式的兼性異氧菌，以有機物為碳源，在污水處理系統(tǒng)中它們是 COD降解的主要參與者［15］.本研究中占絕對優(yōu)勢的β變形菌綱包括索氏菌屬（Thauera）、脫氯單胞菌屬（Dechloromonas）、食酸菌屬（Acidovorax）、固氮弧菌屬（Azoarcus）、貪銅菌屬（Cupriavidus）和Alicycliphilus屬.OTU1是反應(yīng)器中最優(yōu)勢OTU，占所有克隆的36.76%，在已知的可培養(yǎng)細菌中，OTU1序列和焦化廢水處理廠分離得到的Thauera屬反硝化菌Thauera sp.Q20-C（GU566032.1）序列有83%的相似性，Thauera 屬是β-Proteobacteria綱下的一類革蘭氏陰性細菌，大多為桿狀且具有反硝化能力，是一類廣泛存在于各種類型的廢水處理裝置中并具有多種芳香族污染物降解能力的重要功能類群，該菌能降解大部分的主要有機物，如苯酚、甲基苯酚和吲哚等［16-19］.OTU2歸類為脫氯單胞菌屬（Dechloromonas sp.），與Dechloromonas sp. R-28400相似度高達99%，是一種具有反硝化除磷功能的可培養(yǎng)菌［20］. OTU4歸類于食酸菌屬（Acidovorax sp.），與Acidovorax sp.2FB7相似性為94%，Acidovorax sp.可以以果糖等68種有機物作為碳源，供其生長［21］.OTU5與Azoarcus toluvorans的相似度為83%，屬于固氮弧菌屬，先前對固氮弧菌的研究主要集中其固氮能力上［22-24］，近來學者們也在這個菌屬里發(fā)現(xiàn)了一系列的有機污染物的降解菌. OTU7是具有脫氮屬性的隸屬于叢毛單胞菌科Alicycliphilus屬的反硝化菌，研究表明，Alicycliphilus屬的一些菌株還具有在一定條件下降解芳香類化合物的能力［25］.OTU8和OTU9均為假單胞菌屬，為典型的兼性厭氧反硝化細菌，假單胞菌屬（Pseudomona sp.）是已知反硝化菌中最大的分類群之一，該屬中的多個種已被作為研究反硝化過程的模式菌株.王弘宇等［26］發(fā)現(xiàn)生物陶粒脫氮反應(yīng)器內(nèi)假單胞菌屬對氮素的去除率高達43.90%.OTU10歸類為嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila），屬于弧菌科氣單胞菌屬（Aeromonas）.

2.5 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

圖2 細菌nirS基因的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 The phylogenetic analysisi of bacteria nirS gene

用MEGA4.0軟件將不同OTU細菌的12個序列與相應(yīng)的最相似已知菌種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，樹圖主要節(jié)點bootstrap值＞50%，自展樹為100，以嗜熱菌Aquefexpyrophilus（M83548）為外類群，采用鄰接法得到的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示.由圖2可知，該池細菌種類豐富，12個克隆子分別與β類群、γ類群和未知類群等聚在一起.

3 結(jié)論

3.1 通過構(gòu)建反硝化細菌nirS克隆文庫，分析了同步硝化反硝化系統(tǒng)中好氧池反硝化細菌的組成，該池反硝化菌包括β-Proteobacteria、γ-Proteobacteria和Uncultured bacterium，其中β-變形菌為系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌群，在克隆文庫中所占的比例為54.41%，γ-變形菌次之，占文庫的25%，此外還有相當一部分未培養(yǎng)的環(huán)境樣品.

3.2 β-變形菌綱中的Thauera屬為系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌屬，占所有克隆子的36.76%，是一類廣泛存在于各種類型的廢水處理裝置中并具有多種芳香族污染物降解能力的重要功能類群.

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Analysis of denitrifying bacteria community composition in simultaneous nitrification and denitrification systems.

ZHENG Lin-xue1， LI Jun1*， HU Jia-wei1， HOU Ai-yue1， BIAN Wei1， ZHENG Zhao-ming1（1.Key Laboratory of Beijing for Water Quality Science and Water Environment Recovery Engineering， Beijing University of Technology， Beijing 100124， China）. China Environmental Science， 2015，35（1）：116～121

The diversity of denitrifying bacteria in the aerobic tank of a simultaneous nitrification and denitrification system was studied by building nirS cloning library chain reaction （PCR） and molecular cloning. 75 clones were randomly selected from the cloning library to be sequenced and blasted. 74 clones belonged to three different bacteria groups，including β-proteobacteria、γ-proteobacteria and uncultured bacterium. β-proteobacteria was the dominant bacterial group in the aerobic tank， which accounted for 54.41% in the library； γ-proteobacteria was the second group and accounted for 25%. 12 OTU were selected from the 74 sequenced clones for phylogenetic analysis using MEGA software， the Thauera was the main denitrifier genera in the system.

simultaneous nitrification and denitrification；denitrifying bacteria；nirS clone library；bacterial diversity

X172

A

1000-6923（2015）01-0116-06

鄭林雪（1990-），女，河北唐山人，北京工業(yè)大學碩士研究生，主要從事污水生物處理研究.

2014-04-23

北京市自然科學基金（8122005）；國家水體污染控制與治理科技重大專項（2014ZX07201-011）

* 責任作者， 教授， jglijun@bjut.edu.cn