吖啶橙熒光染色法在循環(huán)腫瘤細胞篩查中的應用

劉敏，馬富玲，韓榮，李美，劉淑芬，張淑敏

診斷技術

吖啶橙熒光染色法在循環(huán)腫瘤細胞篩查中的應用

劉敏，馬富玲△，韓榮，李美，劉淑芬，張淑敏

目的應用吖啶橙熒光（AO-F）染色法搭建循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）篩選平臺，并將其應用于腎癌患者外周血CTCs篩查。方法選擇轉(zhuǎn)移性腎細胞癌患者27例（研究組），用不同濃度的血清培養(yǎng)腎癌原代腫瘤細胞和細胞系769-P，分別制備涂片于熒光顯微鏡下，觀察細胞形態(tài)及著色情況是否一致；隨機計數(shù)5個視野下AO-F陽性（+）細胞占769-P細胞的比例，評估AO-F染料對腫瘤細胞的敏感性；清晨抽取10例健康體檢者（對照組）空腹外周血，紅細胞裂解后富集單個核細胞，配制含1×106個細胞的懸液；取對數(shù)生長期腎腫瘤細胞，配制成每管分別含500、200、100、50、10個腫瘤細胞的懸液，與1×106個單個核細胞混合，建立腎癌外周血CTCs模型，AO-F染色后計算腫瘤細胞回收率；另計算2組外周血AO-F+細胞的檢出率，分析其與患者臨床參數(shù)之間的關系。結果腎癌原代腫瘤細胞和細胞系769-P均呈現(xiàn)出鮮明色彩，兩者具有相似的形態(tài)學特征，平均每個視野下AO-F+細胞占腫瘤細胞的比例為93%±3%。含500、200、100、50個細胞的懸液組腫瘤細胞回收率（%）分別為10.2±3.8、9.2±2.3、10.8±2.6、10.5±1.9，組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。含10個細胞的懸液組偶然可檢測到AO-F+細胞。對照組無一例陽性，研究組9例檢測到AO-F+細胞，檢出率為33.33%；檢出率在不同年齡、性別、腫瘤大小、病理類型、Furhman分級、轉(zhuǎn)移部位及帶瘤狀態(tài)間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論AO-F染色法篩查腎癌患者外周血CTCs切實可行，并具有高度的特異性和可重復性，對早期預測腎癌復發(fā)轉(zhuǎn)移有一定參考價值。

吖啶橙；顯微鏡檢查，熒光；癌，腎細胞；循環(huán)腫瘤細胞

近年來，循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）作為腫瘤的“液體活檢標本”，在腫瘤早期診斷、療效判定、預后判斷方面的價值備受關注。CTCs的出現(xiàn)可作為評估腫瘤患者預后的因素之一，并與腫瘤有無復發(fā)轉(zhuǎn)移有關［1］。近年來有許多前沿技術應用于CTCs檢測，目前只有Cell Search系統(tǒng)得到歐美國家認同。Cell Search系統(tǒng)通過細胞表面標志富集CTCs，但因腎癌細胞缺乏特異性標志物限制了其在腎癌領域的應用。吖啶橙（acridine orange fluorescent，AO-F）作為一種熒光絡黃染料，具有高度異染性，已經(jīng)應用于胸水、腹水、尿液等標本的腫瘤細胞檢測［2］。本研究旨在建立吖啶橙熒光法篩查CTCs的技術，并將其應用于腎癌患者的早期診斷及術后隨訪。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇2013年7月—2014年5月我院收治的轉(zhuǎn)移性腎細胞癌患者27例（研究組），其中男19例，女8例；年齡28～79歲，平均（61.63±12.04）歲?；颊呔忻鞔_病理組織學診斷證實為腎細胞癌，且具有充分臨床或影像學證據(jù)確診為轉(zhuǎn)移性腎細胞癌，均未接受任何治療。另擇10例健康體檢者作對照組，其中男6例，女4例；年齡26～79歲，平均（50.1±16.88）歲。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準，且獲研究對象知情同意。

1.2主要試劑和儀器769-P細胞系購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，RPMI-1640培養(yǎng)基、熱滅活胎牛血清、淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物科技有限公司，胰蛋白酶、膠原酶Ⅱ、紅細胞裂解液購自北京索萊寶科技有限公司，熒光顯微鏡（Olympus BX51），離心機（BAIYANG B160A），超凈臺（Labeier），CO2培養(yǎng)箱（Forma Scientific）。

1.3方法

1.3.1腫瘤細胞培養(yǎng)新鮮腎癌組織經(jīng)膠原酶Ⅱ消化，加淋巴細胞分離液，離心獲得原代腎癌細胞。加含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2條件下傳代培養(yǎng)。同時將769-P細胞系加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待細胞覆蓋瓶底80%時，胰蛋白酶消化后按1∶3傳代。每5 d傳代1次。取對數(shù)生長期769-P細胞備用。

1.3.2AO-F染色評估AO-F染料對腫瘤細胞的敏感性分別制備原代和769-P細胞涂片，涂片經(jīng)AO-F染色：AO-F染液中浸泡3 min，PBS沖洗；HCl溶液沖洗5 s，PBS沖洗；CaCl2溶液浸泡3 min，PBS沖洗。加蓋片于熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及著色情況。隨機讀取5個視野計算AO-F陽性（+）細胞占769-P細胞的比例，評估AO-F染料對腫瘤細胞的敏感性。

1.3.3富集對照組外周血單個核細胞對照組清晨空腹抽取肘正中靜脈血5 mL，低張紅細胞裂解液破紅，乙二胺四乙酸（EDTA）漂洗后固定2次，2 000 r/min離心10 min，獲得單個核細胞。制備細胞涂片，經(jīng)AO-F染色后熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及著色情況。同時PBS逐級稀釋，配制含1×106個細胞的懸液置于玻璃管中，共20管，備用。

1.3.4模擬腎癌患者外周血樣取對數(shù)生長期的769-P，計數(shù)后PBS逐級稀釋，配制成每管分別含500、200、100、50、10個769-P細胞的懸液，與1×106個單個核細胞混合，模擬腎癌患者外周血樣，離心、固定、涂片、染色，重復4次，計算腫瘤細胞回收率。

1.3.5檢測研究組外周血中AO-F+細胞研究組患者于清晨空腹抽取肘正中靜脈血6 mL。為避免污染摒棄前1 mL。按1.3.3中方法于2 h內(nèi)處理。計算AO-F+細胞的檢出率，并分析檢出率與患者臨床病理參數(shù)之間的關系。

1.4實驗結果判讀（1）AO-F+細胞：細胞明顯增大，核異型性明顯，核漿比例失調(diào)；胞核、胞漿均著色，胞核呈亮黃綠色，邊緣不齊；胞漿呈桔紅色，含量少，即為CTCs。（2）AO-F陰性（-）細胞：細胞體積小，可見多核、桿狀核、分葉核等白細胞亞群；胞核呈亮綠色熒光，胞漿不著色。

1.5統(tǒng)計學方法應用SPSS 17.0軟件進行處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析。計數(shù)資料組間比較采用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1腫瘤細胞生長特點細胞生長迅速且良好，3次傳代后，質(zhì)量和數(shù)量均能滿足后續(xù)實驗要求。見圖1。

Fig.1The primary renal cancer cells observed under inverted microscope（×200）圖1 原代腎癌細胞光鏡觀察（×200）

2.2各組AO-F染色情況比較AO-F染色后，原代細胞和細胞系均呈現(xiàn)出鮮明色彩，兩者具有相似的形態(tài)學特征：細胞大小不一，形態(tài)各異，核漿比例失調(diào)，胞核呈明亮黃綠色，胞漿呈鮮亮桔紅色，見圖2a。對照組外周血白細胞大小均一，胞核被染為亮綠色，胞漿不著色，可見各亞群細胞核形態(tài)，見圖2b；研究組涂片上可見到兩類細胞，大部分為白細胞，僅有個別AO-F+的腫瘤細胞，數(shù)目少，但醒目（箭頭所示），見圖2c。

Fig.2Comparison of AO-F staining between three groups（×200）圖2 各組細胞AO-F染色情況比較（×200）

2.3AO-F染料對腫瘤細胞的敏感性及腫瘤細胞回收率平均每個視野下AO-F+細胞占769-P細胞的比例為93%±3%。含500、200、100、50個細胞的懸液組腫瘤細胞回收率（%）分別為：10.2±3.8、9.2± 2.3、10.8±2.6、10.5±1.9，組間差異無統(tǒng)計學意義（F= 1.001，P＞0.05）。含10個細胞的懸液組偶然可檢測到AO-F+細胞。

2.4研究組CTCs檢出率及與臨床病理資料的關系9例檢測到AO-F+細胞，檢出率為33.33%。檢出率在不同年齡、性別、腫瘤大小、病理類型、Furhman分級、轉(zhuǎn)移部位及帶瘤狀態(tài)間差異均無統(tǒng)計學意義，見表1。

Tab.1Clinical parameters and AO-F positive rate in 27 patients with metastasized renal cancer表1 27例轉(zhuǎn)移性腎細胞癌患者CTCs檢測結果及與臨床病理資料的關系例（%）

3 討論

腫瘤微轉(zhuǎn)移是單個細胞或微小細胞團形式存在的隱匿性轉(zhuǎn)移，存在于血液循環(huán)中，但常規(guī)臨床病理學和影像學方法均不能檢出，需要借助特殊手段才能檢出。早在1869年，澳大利亞學者Ashworth首次提出了CTCs的概念。細胞自原發(fā)灶脫落進入血液循環(huán)在遠處組織、器官增殖并形成轉(zhuǎn)移灶，這部分進入循環(huán)系統(tǒng)的細胞即被稱之為CTCs。腫瘤細胞進入外周血中是發(fā)生微轉(zhuǎn)移以及遠處轉(zhuǎn)移的前提［3］。因此，檢測CTCs對監(jiān)測腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移有重要意義。

目前許多前沿技術已經(jīng)應用到CTCs檢測，如RT-PCR、microRNA、生物芯片等［4-5］，但各自因其不能克服的缺點未被認可。Cell Search系統(tǒng)是目前國際上唯一認可的技術，已被批準用于乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌中CTCs的檢測。腎癌是泌尿系統(tǒng)常見腫瘤之一，起源于腎小管上皮細胞，術后患者死亡的主要原因是發(fā)生轉(zhuǎn)移。腎癌作為上皮組織來源的腫瘤，理論上細胞角蛋白（cytokeratin，CK）表達率應該較高，但Gradilone等［6］選用CK8/18/19抗體標志腫瘤細胞對25例轉(zhuǎn)移性腎癌患者血中CTCs使用Cell Search系統(tǒng)進行檢測，檢出率僅有16%，同時對檢出的CTCs行RT-PCR擴增，發(fā)現(xiàn)CK8/18/19表達率極低，表明腎腫瘤細胞表面抗原進入血液循環(huán)成為CTCs后發(fā)生了變化，導致其表面缺乏特異性腫瘤標志物。由于腫瘤的異質(zhì)性，Cell Search系統(tǒng)通過細胞表面標志物篩查CTCs，不可避免地使不表達特異性標志物的腫瘤細胞亞群“逃脫法網(wǎng)”，造成一定的假陰性。另外由于檢測成本和技術要求較高，難于在基層醫(yī)院普及，這些都使得Cell Search系統(tǒng)的臨床價值得不到體現(xiàn)。因此，發(fā)展一種新的檢測方法很有必要。

AO-F作為一種熒光絡黃染料，具有高度異染性，被廣泛應用于醫(yī)學和生物學的研究中。AO-F染色法的原理是腫瘤細胞能夠特異性地與DNA和RNA結合，從而使腫瘤細胞變成“彩色”，在顯微鏡下明顯區(qū)別于正常外周血單個核細胞。此法綜合細胞形態(tài)學和細胞化學兩方面的特點來判斷細胞良、惡性，為不表達特異性標志物的CTCs檢測提供了新思路。

本研究結果顯示，AO-F染色后平均每個視野下AO-F+細胞占769-P細胞的比例為93%±3%，證實AO-F染料對腫瘤細胞敏感性高。一定數(shù)量的腫瘤細胞與健康外周血單個核細胞混合，建立腎癌外周血CTCs模型，用AO-F法進行檢測，結果顯示各組腫瘤細胞回收率差異無統(tǒng)計學意義，提示應用AO-F法檢測CTCs較穩(wěn)定，具有較好可重復性。含10個細胞的懸液組偶然可檢測到AO-F+細胞，與李燕等［7］建立的膜濾過聯(lián)合激光掃描細胞計量儀（ISET+LSC）檢測CTCs相比，回收率基本相仿，但較新近出現(xiàn)的CTCs芯片技術相比，尚不夠理想。整個過程中的離心、漂洗、計數(shù)、染色以及AO耐光性弱的內(nèi)在特性［8］等都可造成不同程度的細胞丟失，需繼續(xù)優(yōu)化。對照組未檢測到AO-F+細胞，提示該方法有較高的特異性。

本研究結果顯示，研究組有9例采用AO-F染色法檢測到CTCs，檢出率為33.33%。檢出率在不同年齡、性別、腫瘤大小、病理類型、Furhman分級、轉(zhuǎn)移部位及帶瘤狀態(tài)間差異均無統(tǒng)計學意義。李蕾等［9］研究顯示乳腺癌患者血中CTCs檢出率與轉(zhuǎn)移部位存在一定關系。本研究未發(fā)現(xiàn)兩者存在相關關系，可能與腫瘤類型、樣本例數(shù)大小有關，尚需大樣本研究驗證。Bluemke等［10］檢測154例腎癌患者的233份血樣中的CTCs發(fā)現(xiàn)，CTCs檢出率與患者年齡、性別、腫瘤大小無關，與本研究結果基本一致，另外該研究發(fā)現(xiàn)CTCs是腎癌的獨立預后因素之一，與淋巴結陽性及轉(zhuǎn)移密切相關。對于已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移但外周血中未檢出CTCs的患者，這種不一致性可能是由于腫瘤細胞釋放進入血液的周期性變化以及疾病進展過程中腫瘤組織與宿主免疫狀態(tài)的相互抗衡等導致的［11］。

AO-F法篩查CTCs作為一種新的檢測方法有其獨特優(yōu)勢，可以提供CTCs形態(tài)學和細胞化學方面的詳細信息，且克服腫瘤細胞異質(zhì)性等問題，為不表達特異性上皮標志物的CTCs檢測提供了新思路。

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（2014-10-13收稿 2015-03-02修回）

（本文編輯 陳麗潔）

The application of acridine orange fluorescent staining method in circulating tumor cell

LIU Min，MA Fuling△，HAN Rong，LI Mei，LIU Shufen，ZHANG Shumin
Department of Urology，The Second Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin Institute of Urinary Surgery，Tianjin 300211，China△

ObjectiveTo establish the screening platform of circulating tumor cells（CTCs）using acridine orange fluo?rescent（AO-F）dyeing method，and to apply it in the screening of peripheral blood CTCs in patients with kidney cancer. MethodsTwenty-seven patients with metastatic renal cell carcinoma was included in this study.Primitive tumor cells and kidney cancer cell line 769-P were cultured with different concentrations of fetal bovine serum.Smears were prepared and observed under fluorescence microscopy.The percentage of AO-F positive staining of 769-P cells under 5 random sights was calculated.The sensitivity of AO-F staining to cells was evaluated.The 5 mL morning fasting venous blood was obtained from 10 subjects with healthy check-up.The 1×106cell suspension was prepared.The logarithmic phase of renal tumor cells was used to prepare tube containing 500，200，100，50 and 10 tumor cell suspension，which were mixed with 1×106nucleated cells to establish CTCs model of renal cancer.AO-F staining method was used to detect the expression of AO-F positive cells.The correlation between expression of AO-F positive cells and clinical parameters was analyzed.ResultsThe prima?ry cells and cell line 769-P showed similar bright color and morphological characteristics.The percentage of AO-F positive staining in 769-P cells was 93%±3%under 5 random sights.The recovery rates（%）of four groups（500，200，100 and 50 tu?mor cell suspension）were 10.2±3.8，9.2±2.3，10.8±2.6 and 10.5±1.9，respectively.There were no significant differences in recovery rates between four groups（P＞0.05）.The group of 10 tumor cell suspension could find AO-F positive staining cells occasionally.Zero case was positive in controls.Nine of 27 patients were positive and the rate was 33.33%.There were no significant statistical differences in AO-F positive rates between gender，age，tumor size，pathological pattern，F(xiàn)urhman stage，metastasis of lung and presence of tumor（P＞0.05）.ConclusionIt is confirmed that the method of CTCs staining with AO-F，which has high specificity and reproducibility，is feasible to detect CTCs and worthy of being studied.There is a certain reference value to predict tumor recurrence and metastasis.

acridine orange；microscopy，fluorescence；carcinoma，renal cell；circulating tumor cells

R737.11；R446-39

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.025

天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所（郵編300211）

劉敏（1989），女，碩士在讀，主要從事腎癌循環(huán)腫瘤細胞臨床價值研究

△通訊作者E-mail：18722569796@163.com