蓮心堿促進(jìn)膀胱癌5637細(xì)胞凋亡增強(qiáng)Caspase-7表達(dá)及活化

徐賓，張?zhí)煊怼?，譚寧，閆亓，徐伶俐，劉曉佳，高漓

蓮心堿促進(jìn)膀胱癌5637細(xì)胞凋亡增強(qiáng)Caspase-7表達(dá)及活化

徐賓1，張?zhí)煊?△，譚寧2，閆亓1，徐伶俐3，劉曉佳4，高漓1

目的研究蓮心堿（Liensinine）對(duì)膀胱癌細(xì)胞株5637凋亡的影響，初步探討其作用機(jī)制。方法使用CCK-8法及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蓮心堿對(duì)5637細(xì)胞增殖的抑制作用；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV-FITC/PI雙染法測(cè)定蓮心堿對(duì)5637細(xì)胞凋亡的影響；采用Western blot技術(shù)分析細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-7表達(dá)狀況。結(jié)果CCK-8法及克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明蓮心堿對(duì)膀胱癌細(xì)胞5637增殖有明顯的抑制作用，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示蓮心堿可使膀胱癌5637細(xì)胞發(fā)生早期凋亡；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示蓮心堿增強(qiáng)5637細(xì)胞Caspase-7表達(dá)并促進(jìn)其活化。結(jié)論蓮心堿可抑制5637細(xì)胞增殖，使其發(fā)生早期凋亡，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)Caspase-7表達(dá)及活化有關(guān)。

膀胱腫瘤；生物堿類(lèi)；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；半胱氨酸內(nèi)肽酶類(lèi)；蓮心堿；Caspase-7

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，而非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（NMIBC）約占膀胱癌的80%［1］，治療以經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)輔以術(shù)后灌注化療為主。但目前的化療藥物并不能很好地解決膀胱腫瘤術(shù)后易復(fù)發(fā)的問(wèn)題。尋求療效更好、不良反應(yīng)少的灌注治療藥物，一直是泌尿外科的研究熱點(diǎn)。蓮心堿（Liensinine）是從蓮子的胚芽中提取出的一種雙芐基異喹啉類(lèi)生物堿，具有降血壓、抗心律失常、抗脂質(zhì)過(guò)氧化，抗血小板凝集、抗血栓及保護(hù)心腦血管活性等作用［2］。此外，本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)，蓮心堿具有抑制膀胱癌T24細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期阻滯的作用［3］。為進(jìn)一步了解蓮心堿對(duì)膀胱癌5637細(xì)胞凋亡的影響，筆者以人膀胱癌細(xì)胞株5637為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，以期為膀胱癌術(shù)后臨床治療提供新的備選方案及理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料人膀胱癌5637細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心，蓮心堿（上海源葉有限公司，貨號(hào)為YY90562 CAS:#25.00086-96-1，蓮心堿溶于甲醇，制成20 g/L儲(chǔ)備液），DMEM高糖培養(yǎng)液（GIBCO公司，貨號(hào)：C11995500BT），胎牛血清FBS（Corille公司，貨號(hào)：C1015-05），CCK-8試劑（上海同仁化學(xué)研究所，貨號(hào)：CK04），Cas?pase-7單克隆抗體（CST公司，貨號(hào)：12827），β-actin（鼠源性，SANTA CRUZ公司），AnnexinV-FITC/PI試劑（東仁化學(xué)科技上海有限公司，貨號(hào)：AD10）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人膀胱癌細(xì)胞5637培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中（含青鏈霉素），用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期膀胱癌5637細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，以1 000個(gè)/孔濃度接種于96孔板。24 h細(xì)胞貼壁后，加入蓮心堿使其終濃度為1.562、3.125、6.250、12.500、25.000 mg/L，對(duì)照組加等體積甲醇，同一濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。檢測(cè)前，棄去培養(yǎng)基，在每孔加入100μL CCK-8檢測(cè)試劑，37℃孵育2 h后，置于連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（infinite M200 PRO），讀取450 nm波長(zhǎng)處吸光度（A）值，分別記錄加藥后2 h及第1、2、3、4天數(shù)值。然后計(jì)算出蓮心堿2、3、4 d的半數(shù)抑制濃度（IC50）值及各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率（%）=（對(duì)照組A450值-干預(yù)加藥組A450值）/對(duì)照組A450值×100%。

1.4克隆形成實(shí)驗(yàn)6孔培養(yǎng)板接種1 200個(gè)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人膀胱癌5637細(xì)胞。37℃、5%CO2孵育24 h后，加入藥液使蓮心堿終濃度為1.562、3.125、6.250、12.500、25.000 mg/L，待藥物作用5637細(xì)胞達(dá)7 d后。棄去上清液，PBS溶液浸洗2次，加入4%多聚甲醛固定15 min，棄固定液，加入結(jié)晶紫染液染色15 min，洗去染液，空氣中干燥，掃描圖像。然后加入10%冰醋酸溶液2 mL，靜置30 min，結(jié)晶紫溶解后，取100μL加入96孔板中，使用連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（infinite M200 PRO），讀取各孔560 nm波長(zhǎng)處A值并計(jì)算克隆抑制率。克隆抑制率（%）=（對(duì)照組A560值-干預(yù)加藥組A560值）/對(duì)照組A560值×100%。

1.5細(xì)胞凋亡檢測(cè)用10 cm培養(yǎng)皿接種2×105個(gè)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5637細(xì)胞，37℃、5%CO2孵育24 h，待貼壁后，加入蓮心堿使其濃度為1.562、3.125、6.250、12.500、25.000 mg/L。待藥物作用于5637細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞并離心、棄上清液，PBS洗滌2次，離心，棄上清液，1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，并吹打混勻，加入5μL AnnexinV/FITC和10μL PI染色液（20 mg/L），避光30 min。篩網(wǎng)過(guò)濾，使用流式細(xì)胞儀（BD FACS AriaⅢ）測(cè)定采集數(shù)據(jù)。

1.6Western blot檢測(cè)收集培養(yǎng)細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，用蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠（12%分離膠＋6%濃縮膠）電泳后轉(zhuǎn)移至NC膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌，二抗37℃孵育2 h，TBST洗滌，與免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）反應(yīng)，X線片曝光，顯影，定影。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多個(gè)樣本間的均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Bonferroni-t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1蓮心堿具有抑制5637細(xì)胞增殖的作用蓮心堿作用2 h后各濃度加藥組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.778，P＞0.05）。蓮心堿作用1 d后（F=58.86，P＜0.05），1.562、3.125、6.250 mg/L各濃度組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），12.500、25.000 mg/L蓮心堿組與其他組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。蓮心堿作用2、3、4 d后，各濃度組與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為151.217、170.535、195.366，P＜0.05），見(jiàn)圖1。分別用1.562、3.125、6.250、12.500、25.000 mg/L蓮心堿作用2 d后，5637細(xì)胞增殖抑制率分別為（11.51±0.07）%、（21.31±0.04）%、（29.97±0.43）%、（49.98±0.05）%、（60.38±0.03）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=51.786，P＜0.05）。藥物作用2、3、4 d后，CCK-8法求得5637細(xì)胞IC50值分別為22.36、7.37、6.40 mg/L。

Fig.1Liensinine inhibited the proliferation of 5637 cells in dosedependent manner圖1 蓮心堿以劑量依賴的方式抑制5637細(xì)胞增殖

2.2蓮心堿對(duì)克隆形成的抑制作用（1）蓮心堿各加藥組與對(duì)照組克隆形成抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=120.628，P＜0.05）。（2）1.562、3.125、6.250、12.500、25.000 mg/L蓮心堿作用7 d后，克隆抑制率分別為（35.04±0.04）%、（50.32±0.01）%、（68.10± 0.02）%、（84.39±0.01）%、（92.74±0.01）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=386.879，P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.3蓮心堿促進(jìn)膀胱癌5637細(xì)胞凋亡見(jiàn)圖3。5637細(xì)胞在不同濃度蓮心堿干預(yù)后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞早期凋亡比例明顯增加，對(duì)照組及1.562、3.125、6.250、12.500、25.000 mg/L加藥組早期凋亡細(xì)胞所占比例分別為（2.77±0.09）%、（3.40±0.10）%、（3.57±0.09）%、（4.50±0.15）%、（5.07±0.15）%、（9.63± 0.12）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=442.442，P＜0.05）。加藥組對(duì)5637細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用。

2.4蓮心堿上調(diào)膀胱癌5637細(xì)胞Caspase-7表達(dá)水平蓮心堿組與對(duì)照組相比，Caspase-7表達(dá)及其活化水平在蓮心堿干預(yù)后出現(xiàn)明顯上調(diào)，見(jiàn)圖4。

Fig.2Liensinine inhibited colony formation of 5637 cells圖2 蓮心堿抑制5637的細(xì)胞克隆形成

Fig.3Liensinine promoted the apoptosis of bladder cancer 5637 cells圖3 蓮心堿促進(jìn)膀胱癌5637細(xì)胞凋亡

Fig.4Liensinine up-regulated the expression of Caspase-7 and promoted its activation圖4 蓮心堿上調(diào)5637細(xì)胞Caspase-7蛋白表達(dá)及其活化水平

3 討論

膀胱癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，2008年以來(lái)，60歲以上的中國(guó)人膀胱癌發(fā)病率已超過(guò)腎腫瘤，居泌尿系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率第1位［4］。當(dāng)前，膀胱癌的防治形勢(shì)更加嚴(yán)峻，鑒于其術(shù)后復(fù)發(fā)率高，目前臨床一線用藥如吡柔比星、卡介苗等并不能有效控制復(fù)發(fā)，尋求術(shù)后有效治療藥物十分必要。有關(guān)蓮心堿的研究表明其具有保護(hù)心腦血管活性的作用［5］，但是其在膀胱癌治療方面的研究少有報(bào)道。

本研究采用了CCK-8法及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蓮心堿對(duì)5637細(xì)胞增殖的抑制作用。CCK-8法結(jié)果表明蓮心堿對(duì)膀胱癌5637細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，隨藥物濃度的增加，抑制作用更加明顯。克隆形成實(shí)驗(yàn)表明隨藥物濃度的增加，克隆抑制率呈現(xiàn)明顯的升高趨勢(shì)，藥物作用7 d后，3.125 mg/L抑制率即可達(dá)到50%，上述結(jié)果均表明蓮心堿對(duì)膀胱癌5637細(xì)胞增殖的抑制作用明顯，體現(xiàn)了蓮心堿良好的體外抗腫瘤效應(yīng)。

細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖的平衡狀態(tài)可保證細(xì)胞數(shù)目的穩(wěn)定，而細(xì)胞凋亡的抑制則可能引起腫瘤的產(chǎn)生［6-7］。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的作用靶點(diǎn)之一，許多抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用也是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)的［8］。細(xì)胞凋亡率是評(píng)價(jià)藥物抗癌效果的一項(xiàng)指標(biāo)［9］。本研究通過(guò)不同濃度蓮心堿作用于膀胱癌5637細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，隨蓮心堿濃度的增加，5637細(xì)胞早期凋亡率逐漸上升，這表明蓮心堿可以促進(jìn)膀胱癌5637細(xì)胞的凋亡，且該促進(jìn)作用主要發(fā)生在細(xì)胞凋亡的早期階段。

Caspase是一類(lèi)在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起到核心作用的蛋白酶，是細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵效應(yīng)分子，也是多種細(xì)胞凋亡途徑中的共同作用因子，細(xì)胞凋亡程度與其表達(dá)水平的高低有關(guān)［10］。Caspase已經(jīng)在多種細(xì)胞系中被證實(shí)可在凋亡的起始和執(zhí)行階段被激活［11］。Caspase-7是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族成員之一，它和Caspase-3共同被認(rèn)為是凋亡的最終執(zhí)行者。有研究發(fā)現(xiàn)Caspase-7的變異與中國(guó)東部地區(qū)胃癌易感性相關(guān)［12］。人體的多種腫瘤如胃癌、結(jié)腸癌及肺癌［13-14］等都有Caspase-7的低表達(dá)或變異。本研究結(jié)果表明，蓮心堿可以通過(guò)促進(jìn)Caspase-7的表達(dá)和活化來(lái)誘導(dǎo)膀胱癌5637細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，蓮心堿可能通過(guò)上調(diào)Caspase-7的表達(dá)及活化，促進(jìn)膀胱癌5637細(xì)胞發(fā)生早期凋亡，從而抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖。蓮心堿的體外抗腫瘤作用為膀胱癌的治療提供了新思路，具有成為膀胱癌治療藥物的潛力。但本研究為體外實(shí)驗(yàn)，不能完全模擬復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境。因此，蓮心堿對(duì)膀胱癌的治療作用需要進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及相關(guān)臨床試驗(yàn)的證實(shí)。

［1］Nargund VH，Tanabalan CK，Kabir MN.Management of non-mus?cle-invasive（superficial）bladder cancer［J］.Semi Onco，2012，39（5）:559-572.doi:10.1053/j.seminoncol.2012.08.001.

［2］Wang H，Liu G，Luo SD.Effects of Liensinine aggregation，coagula? tion and thrombosis of platelet［J］.C P B，2010，26（6）:768-771.［王輝，劉剛，羅順德.蓮心堿對(duì)血小板聚集、凝血功能和血栓形成的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26（6）:768-771］.

［3］Yan Q，Zhang TY，Tan N，et al.Regulation of liensinine on T24 bladder cancer cell proliferation and cycle［J］.Chongqing Medicine，2014，43（25）3268-3271.［閆亓，張?zhí)煊恚T寧，等.甲基蓮心堿對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖及其周期的調(diào)控［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2014，43（25）3268-3271］.doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2014.25.002.

［4］Han SJ，Zhang SW，Chen WQ，et al.Analysis of the status and trends of bladder cancer incidence in China［J］.Onco Pro，2013 11（1）:89-95.［韓蘇軍，張思維，陳萬(wàn)青，等.中國(guó)膀胱癌發(fā)病現(xiàn)狀及流行趨勢(shì)分析［J］.癌癥進(jìn)展，2013，11（1）:89-95］.doi:10.3969/j. issn.1672-1535.2013.01.021.

［5］Yu WG，Zhang HW，Yang T，et al.Antioxidant effect of Liensinine on reperfusion injury of rat focal cerebral ischemia［J］.Pharmacolo?gy and Clinics of Chinese Materia Medica，2013，29（2）:32-35.［余萬(wàn)桂，張恒文，楊濤，等.蓮心堿對(duì)大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的抗氧化作用［J］.中藥藥理與臨床，2013，29（2）:32-35］.doi：10.13412/j.cnki.zyyl.2013.02.014.

［6］Arya AK，Tripathi R，Kumar S，et al.Recent advances on the associ?ation of apoptosis in chronic non healing diabetic wound［J］.World J Diabetes，2014，5（6）:756.doi:10.4239/wjd.v5.i6.756.

［7］Paul I，Jones JM.Apoptosis block as a barrier to effective therapy in non small cell lung cancer［J］.World J Clin Oncol，2014，5（4）:588. doi:10.5306/wjco.v5.i4.588.

［8］Guicciardi ME，Gores GJ.Unshackling Caspase-7 for cancer thera?py［J］.J Clin Invest，2013，123（9）:3706-3708.doi:10.1172/ JCI71440.

［9］Zhang Y，Li JM，Qin BW，et al.The effects of scutellarin on apopto?sis and the expression of caspase-8 in human tongue squamous car?cinoma Tca8113 cells［J］.Tianjin Med J，2015，43（3）:237-240.［張穎，李俊玫，秦博文，等.野黃芩苷對(duì)人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞凋亡及caspase-8表達(dá)的影響［J］.天津醫(yī)藥，2015，43（3）:237-240］. doi：10.3969/j.issn.0253-9896.2015.03.004.

［10］Liu H，Wang Z，Nowicki MJ.Caspase-12 mediates carbon tetrachlo?ride-induced hepatocyte apoptosis in mice［J］.World J Gastroenter?ol，2014，20（48）:18189-18198.doi:10.3748/wjg.v20.i48.18189.

［11］Zhu YP，Bian XJ，Ye DW，et al.Pseudomonas aeruginosamannose?sensitive hemagglutinin inhibits proliferation and induces apoptosis in a caspasedependent manner in human bladder cancer cell lines［J］.Oncol Lett，2013，5（4）:1357-1362.doi:10.3892/ol.2013.1201.

［12］Wang MY，Zhu ML，He J，et al.Potentially functional polymor?phisms in the caspase7 gene contribute to gastric adenocarcinoma susceptibility in an eastern Chinese population［J］.PloS One，2013，8（9）:e74041.doi:10.1371/journal.pone.0074041.

［13］Fu Y，Yang G，Zhu F，et al.Antioxidants decrease the apoptotic ef?fect of 5-Fu in colon cancer by regulating Src-dependent Caspase-7 phosphorylation［J］.Cell Death Dis，2014，5（1）:e983.doi: 10.1038/cddis.2013.509.

［14］Lee SY，Choi YY，Choi JE，et al.Polymorphisms in the caspase genes and the risk of lung cancer［J］.J Thorac Oncol，2010，5（8）: 1152-1158.doi:10.1097/JTO.0b013e3181e04543.

（2015-01-15收稿 2015-04-23修回）

（本文編輯 魏杰）

Liensinine promotes apoptosis of bladder cancer 5637 cells and enhances Caspase-7 expression and activation

XU Bin1，ZHANG Tianyu1△，TAN Ning2，YAN Qi1，XU Lingli3，LIU Xiaojia4，GAO Li1
1 Department of Urology，Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541004，China；2 Center of Science Research，Guilin Medical University；3 Department of Gastroenterology，4 Department of Pathology，Affiliated Hospital of Guilin Medical University△

ObjectiveTo study the effects of Liensinine on apoptosis of 5637 cells，and its mechanism thereof.Meth?odsCCK-8 method and the colony formation test were used to detect cell viabilities，and then inhibition rates were calcu?lated.Flow cytometry was used to detect the effects of Liensinine on apoptosis of 5637 cells.Western blot assay was used to detect Caspase-7 protein expression.ResultsCCK-8 assay and colony formation test indicated that Liensinine inhibited the cell proliferation significantly.Results of flow cytometry indicated that Liensinine induced early apoptosis of 5637 cells. Western blot assay showed that Liensinine improved the expression of Caspase-7 and enhanced the activation of Caspase-7 in 5637 cells.ConclusionLiensinine could inhibit the proliferation of 5637 cells，induce early apoptosis，which may be re?lated with the enhanced expression of Caspase-7 and its activation.

urinary bladder neoplasms；alkaloids；cell proliferation；apoptosis；cysteine endopeptidases；liensinine；Caspase-7

R737.14

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.006

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81360377）；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2010GXNSFA183013）；桂林市科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)項(xiàng)目（20080408）

1桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科（郵編541004）；2桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心；3桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科；4桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科

徐賓（1986），男，碩士研究生，主要從事泌尿系腫瘤研究

△通訊作者E-mail：zhangtianyu64@qq.com