高大山羊草1Sl染色體特異分子標(biāo)記的建立與應(yīng)用

劉曉明+張姝倩+宮文英+等

摘要：導(dǎo)入小麥的高大山羊草（Aegilops longissima）1S1染色體可以顯著提高小麥加工品質(zhì)及子粒Fe和Zn元素含量，因此，1Sl染色體特異分子標(biāo)記的建立對(duì)子粒Fe和Zn元素含量高的高品質(zhì)小麥的選育具有重要意義。試驗(yàn)建立了高大山羊草1S1染色體特異分子標(biāo)記9個(gè)，其中染色體短臂標(biāo)記2個(gè)，長(zhǎng)臂標(biāo)記6個(gè)，同時(shí)定位于長(zhǎng)臂和短臂的標(biāo)記1個(gè)。利用建立的分子標(biāo)記對(duì)雜交群體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，建立的9個(gè)標(biāo)記可以對(duì)分離群體進(jìn)行有效篩選與鑒定。因此，獲得的高大山羊草1Sl染色體特異分子標(biāo)記可以應(yīng)用于雜交群體的篩選、鑒定以及輔助選育子粒Fe和Zn元素含量高的高品質(zhì)小麥。

關(guān)鍵詞：高大山羊草（Aegilops longissima）；1Sl染色體；分子標(biāo)記；小麥育種

中圖分類號(hào)：Q78；S512.1+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）20-4937-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.003

Construction of 1Sl Chromosome-specific Molecular Markers

in Aegilops longissima and Its Application

LIU Xiao-ming1a，ZHANG Shu-qian1b，GONG Wen-ying2，TANG Hai-tian3，WANG Can-guo2，

CHENG Dun-gong2，LIU Cheng2，LIU Jian-jun2

（1a. Research and Development Center of Biotechnology； 1b. School of Chemistry and Environment，Weifang University of Science and Technology， Weifang 262700， Shandong， China； 2.Crop Research Institute， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China； 3.Yantai Oceanic Environmental Monitoring Central Station， Yantai 264006，Shandong，China）

Abstract：Since the wheat introduced Aegilops longissima 1Sl chromosome had significantly higher processing quality and higher content of iron and zinc in grain，the construction Aegilops longissima 1Sl-specific molecular markers was necessary and important for selecting and breeding high quality wheat which with high iron and zinc content. In this research，9 molecular markers specific for Aegilops longissima 1Sl were constructed，in which，2 markers located on the short arm，6 markers located on the long arm，and 1 marker located on both short and long arms.The verification experiment showed that the 9 markers were very available in screening and identifying isolated population.It indicated that the constructed 9 Aegilops longissima 1Sl chromosome-specific molecular markers could be used in cross population screening，identification and high quality wheat breeding.

Key words： Aegilops longissima； chromosome 1Sl； molecular marker； wheat breeding

全球有超過(guò)30億的人口處在體內(nèi)缺Fe和Zn元素的“隱性饑餓”狀態(tài)下，有超過(guò)2.5億兒童不同程度缺乏Fe和Zn元素[1]。中國(guó)小麥子粒礦質(zhì)元素尤其是Fe和Zn元素含量還不能滿足人們的基本需求[2]，因此，需要改良中國(guó)小麥礦質(zhì)元素含量以及選育高品質(zhì)小麥來(lái)改善人們的營(yíng)養(yǎng)狀況。

高大山羊草（Aegilops longissima，2n=14，染色體組為SlSl），是小麥的遠(yuǎn)緣物種及小麥育種的優(yōu)異基因源，高抗小麥白粉病、葉銹病和麥二叉蚜、眼斑病，抗干旱脅迫和鹽脅迫，對(duì)小麥加工品質(zhì)有顯著正效應(yīng)[3]，能夠顯著提高小麥子粒Fe和Zn元素含量[4]。目前，抗小麥白粉病基因Pm13被定位在高大山羊草3Sl染色體短臂上，顯著提高小麥子粒Fe和Zn元素含量[4]、對(duì)小麥加工品質(zhì)有顯著正效應(yīng)的基因[5]和抗眼斑病主效QTL均定位在1Sl染色體上，因此，高大山羊草1Sl染色體分子標(biāo)記的建立將對(duì)相應(yīng)雜交群體的篩選與鑒定及輔助選育子粒Fe和Zn含量高的高品質(zhì)小麥具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

一粒小麥（TA136）、圓錐小麥（TA10543）、高大山羊草（TA1910）、中國(guó)春-高大山羊草1S1附加系（TA3573）、中國(guó)春-高大山羊草2S1-7S1附加系（TA7544-TA7549）、中國(guó)春-高大山羊草1S1短臂（1SlS）和長(zhǎng)臂（1SlL）端體附加系（TA7515和TA7516）和中國(guó)春1B單體（TA6550）由美國(guó)堪薩斯州立大學(xué)植物病理系Gill教授提供。中國(guó)春（CS）、綿陽(yáng)11（MY11）和綿陽(yáng)15（MY15）小麥由電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院楊足君教授提供。Aelon-1-Aelon-101是中國(guó)春1B缺體/中國(guó)春-高大山羊草1Sl附加系雜交F2群體。

1.2 DNA的提取

DNA的提取參照SDS法[6]。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

從國(guó)際小麥EST定位工程網(wǎng)（http：//wheat.pw.usda.gov/NSF/data.html）選用120個(gè)已經(jīng)被定位在小麥染色體第一同源群的EST序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)EST-STS引物120對(duì)。第一同源群的EST-SSR引物22對(duì)、COS引物30對(duì)、PLUG引物42對(duì)和SSR引物16對(duì)的設(shè)計(jì)分別參照文獻(xiàn)[7-10]。上述引物均由成都瑞信生物公司合成。

1.4 PCR擴(kuò)增與電泳

EST-STS引物擴(kuò)增及電泳條件參照文獻(xiàn)[11]，EST-SSR引物、COS引物、PLUG引物和SSR引物擴(kuò)增及電泳條件分別參照文獻(xiàn)[7-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選高大山羊草1Sl染色體特異DNA片段

以中國(guó)春-高大山羊草1Sl附加系與一粒小麥、圓錐小麥、MY11、MY15和CS共5個(gè)小麥對(duì)照為材料，提取其基因組DNA，用合成的230對(duì)引物對(duì)這6份材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別有6對(duì)EST-STS引物（BF200742、BE500714、BE489692、BF604958、BE585781和BG262882）、1對(duì)EST-SSR引物（MAG2137）和2對(duì)SSR引物（Xgwm135和Xgwm140）可以在中國(guó)春-高大山羊草1Sl附加系中擴(kuò)增出特異DNA片段，而對(duì)照一粒小麥、圓錐小麥、MY11、MY15和CS則擴(kuò)增不出這些片段，說(shuō)明這些DNA片段均來(lái)自高大山羊草。其中，引物BG262882和MAG2137的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1A和圖1D。PLUG引物和COS引物則沒(méi)有在材料中擴(kuò)增出多態(tài)性。

2.2 高大山羊草1Sl單染色體特異片段的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證上述獲得的特異片段僅分別分布在1Sl染色體上，以中國(guó)春-高大山羊草1Sl-7Sl附加系和對(duì)照CS為材料，用上述獲得的9對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)這9對(duì)引物僅能在中國(guó)春-高大山羊草1Sl附加系中擴(kuò)增出目標(biāo)特異片段，而其余6個(gè)附加系和CS均未擴(kuò)增出相應(yīng)片段，說(shuō)明這些片段為高大山羊草1Sl染色體特異標(biāo)記。其中，引物BG262882 和引物MAG2137的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1B和圖1E。

2.3 高大山羊草1Sl單染色體臂特異標(biāo)記的建立

為了進(jìn)一步將獲得的9個(gè)第一同源群標(biāo)記定位在高大山羊草染色體臂上，以中國(guó)春-高大山羊草1SlS和1SlL端體附加系為材料，用上述9對(duì)引物對(duì)其擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這9個(gè)標(biāo)記中，2個(gè)被定位在高大山羊草1Sl短臂（1S1S）上，6個(gè)被定位在1Sl長(zhǎng)臂（1SlL）上，1個(gè)標(biāo)記同時(shí)定位在1Sl短臂和長(zhǎng)臂上（表1）。其中，引物BG262882 和引物MAG2137的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1C和圖1F。

2.4 獲得標(biāo)記對(duì)雜交群體的篩選與鑒定

為了驗(yàn)證獲得標(biāo)記的實(shí)用性，從中國(guó)春1B單體（2n=41）后代中篩選出染色體數(shù)目2n=40的1B缺體植株。將中國(guó)春-高大山羊草1Sl附加系與1B缺體進(jìn)行雜交，其雜交F1中因?yàn)榇嬖?B和1Sl雙單體，不能正常配對(duì)，因此，1B和1Sl容易在著絲粒處發(fā)生斷裂并重接。利用獲得的高大山羊草1Sl標(biāo)記對(duì)中國(guó)春-高大山羊草1Sl/1B缺體雜交F2的部分分離群體進(jìn)行篩選。參試的101個(gè)單株中，Aelon-1、Aelon-19和Aelon-20等31個(gè)植株可以擴(kuò)增出1S1長(zhǎng)臂標(biāo)記，但是不能擴(kuò)增出短臂標(biāo)記（圖2），說(shuō)明這31個(gè)植株中只含有1Sl長(zhǎng)臂染色體而沒(méi)有1Sl短臂染色體。Aelon-5、Aelon-7和Aelon-17等35個(gè)植株不能擴(kuò)增出1Sl長(zhǎng)臂標(biāo)記，但是可以擴(kuò)增出短臂標(biāo)記（圖2），說(shuō)明這35個(gè)植株中不含1Sl長(zhǎng)臂染色體而含有1Sl短臂染色體。Aelon-9、Aelon-12和Aelon-52等10個(gè)植株不能擴(kuò)增1Sl長(zhǎng)臂標(biāo)記，也不能擴(kuò)增出1Sl短臂標(biāo)記（圖2），說(shuō)明這10個(gè)植株中不含有1Sl染色體。Aelon-4、Aelon-6和Aelon-8等25個(gè)植株既能擴(kuò)增1Sl長(zhǎng)臂標(biāo)記，也能擴(kuò)增出1Sl短臂標(biāo)記（圖2），說(shuō)明這25個(gè)植株中含有1Sl染色體或同時(shí)含有1Sl染色體長(zhǎng)臂和短臂端體。

3 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)基于EST序列的COS引物和PLUG引物并沒(méi)有在供試材料中獲得多態(tài)性，而EST序列的EST-STS引物和EST-SSR引物分別在供試材料中獲得了5.0%（6/120）和4.5%（1/22）的多態(tài)性，因此，基于EST序列的不同引物在小麥外緣物種多態(tài)性標(biāo)記建立效率方面也各有不同?；谖⑿l(wèi)星序列的SSR引物在供試材料中獲得了12.5%（2/16）的多態(tài)性，說(shuō)明在小麥外緣物種多態(tài)性標(biāo)記建立方面，基于基因和非基因水平的序列均應(yīng)考慮在內(nèi)。

在高大山羊草染色體標(biāo)記建立方面，劉旭等[11]建立了高大山羊草基因組RAPD標(biāo)記5個(gè)；Milletet等[12]建立了高大山羊草5Sl染色體的同工酶標(biāo)記；Neelam等[13]建立了2Sl染色體微衛(wèi)星標(biāo)記3個(gè)和7S1染色體標(biāo)記4個(gè)；覃碧等[10]建立了2SlL染色體EST-STS標(biāo)記5個(gè)；Cenci等[14]建立了3SlS染色體上與抗白粉病基因Pm13連鎖的分子標(biāo)記。未見(jiàn)對(duì)1Sl染色體分子標(biāo)記建立的報(bào)道。本研究建立了1Sl染色體分子新標(biāo)記9個(gè)，并且將9個(gè)標(biāo)記被分別定位在1Sl染色體短臂或長(zhǎng)臂上。重復(fù)試驗(yàn)表明，標(biāo)記BE489692-EST-STS同時(shí)存在于1Sl短臂和長(zhǎng)臂上，說(shuō)明相應(yīng)基因在1Sl染色體長(zhǎng)臂或短臂上可能存在復(fù)制現(xiàn)象或1Sl長(zhǎng)短臂上存在引物結(jié)合位點(diǎn)類似序列導(dǎo)致可重復(fù)性非特異擴(kuò)增。對(duì)相應(yīng)雜交群體的篩選結(jié)果表明，本研究建立的9個(gè)標(biāo)記均能有效應(yīng)用于分離群體的篩選和鑒定，可應(yīng)用于涉及高大山羊草1Sl染色質(zhì)導(dǎo)入小麥改良小麥子粒Fe和Zn含量選育高品質(zhì)小麥的育種工作。

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