金黃色葡萄球菌標準物質的定值方法

鄭潔，柯璐，2，張溫玲，2，戴曉麗，2，楊瑋瑋，鄭晶，2

（1.福建出入境檢驗檢疫局技術中心，福建福州350003；2.福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室，福建福州350003；3.福建農(nóng)林大學動物科學學院，福建福州350001）

金黃色葡萄球菌標準物質的定值方法

鄭潔1，柯璐1，2，張溫玲1，2，戴曉麗1，2，楊瑋瑋3，鄭晶1，2

（1.福建出入境檢驗檢疫局技術中心，福建福州350003；2.福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室，福建福州350003；3.福建農(nóng)林大學動物科學學院，福建福州350001）

對含雞肉基質的金黃色葡萄球菌標準物質進行定值，包括金黃色葡萄球菌計數(shù)方式的選擇，標準值的測定，以及不確定度的分析。總不確定度以擴展不確定度表示。結果顯示，金黃色葡萄球菌3種計數(shù)方式，BP平板傾注法計數(shù)結果與PCA計數(shù)法測定一致，BP平板傾注法SD值＜BP平板涂布法SD值，表明采用BP平板傾注法計數(shù)金黃色葡萄球菌的結果精密度、再現(xiàn)性較好，有利于試驗結果的復現(xiàn)。標準值測定結果為275 CFU/瓶；總不確定度為6。因此，標準物質定值結果為（275±6）CFU/瓶。

金黃色葡萄球菌；標準物質；定值；不確定度

標準物質的定值是對標準物質特性量賦值的全過程。標準物質作為計量工具的一種，必須保證其復現(xiàn)、保存和傳遞量值的特性，因此必須保證標準物質的量值具有溯源性，繼而就必須對標準物質研制單位進行計量認證，對所用的分析測量方法進行研究，對測量結果的不確定度進行分析。金黃色葡萄球菌（簡稱金葡菌）是引起食物中毒的常見致病菌，在公共衛(wèi)生學上具有重要意義。作者對含雞肉基質的金葡菌菌體標準物質的定值方法進行了對比研究，建立了該標準物質的定值方式，給今后同類型標準物質的定值驗證提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗樣本

試驗樣本（含雞肉基質的金黃色葡萄球菌標準物質），批次編號為JP0212，由作者所在實驗室提供。樣品檢測前進行了均勻性和穩(wěn)定性試驗，在隨后統(tǒng)計分析與評價中可以忽略樣品不穩(wěn)定性和不均勻性的影響。

1.2儀器與設備

KD-2100TBC電子天平，福建科迪技術有限公司制造；SHKE4450型臺式恒溫振蕩器，美國Thermo公司制造；可調移液器（100～1 000 μL），芬蘭雷勃（中國）公司制造；BC/BD-718A冷藏冷凍箱，青島海爾特種電冰柜有限公司制造；PHW-165Q恒溫培養(yǎng)箱，中科生命科技有限公司研制；MU-425-400E生物安全柜，美國NUAIRE公司制造；MS3 DIGITAL渦旋振蕩器，德國IKA公司制造；Stomacher3500型拍擊式均質器，英國WARD公司制造；HV-85型自動高壓滅菌器，日本HIRYAMA公司制造。

1.3主要培養(yǎng)基的配制

營養(yǎng)肉湯、平板計數(shù)瓊脂（PCA）、腦心浸出液肉湯（BHI肉湯）、Baird-Parker培養(yǎng)基（BP培養(yǎng)基），均購自北京陸橋。

2　試驗方法

2.1金黃色葡萄球菌菌落計數(shù)方法的選擇試驗

2.1.1試驗菌液制備將新鮮培養(yǎng)的菌懸液（含菌量約為3.6×107CFU/mL）渦旋均勻，吸取1 mL加入9 mL無菌生理鹽水，制成體積比1∶10的稀釋液，再依次進行10倍遞增稀釋，使菌液稀釋液的最終含菌量在100 CFU/mL左右。

2.1.2試驗方法分別采用PCA計數(shù)法、Baird-Parker傾注法、Baird-Parker平板涂布法3種計數(shù)方法，對2.1.1項所述制備的試驗菌液進行計數(shù)。

1）PCA計數(shù)法：吸取1 mL制備的菌液稀釋液置于無菌培養(yǎng)皿中，然后倒入15 mL冷卻至50℃的瓊脂計數(shù)培養(yǎng)基，搖勻。待平板冷卻凝固后，在（36±1）℃下倒置培養(yǎng)18～24 h；

2）BP傾注法：吸取1 mL制備的菌液稀釋液，傾注入15 mL冷卻至42℃的BP培養(yǎng)基，搖勻。待平板冷卻凝固后，在（36±1）℃下倒置培養(yǎng)18～24 h；

3）BP平板涂布法：取3片制好的BP瓊脂平板，將制備的菌液稀釋液以0.2、0.3、0.4 mL的量分別加入到3個平板中（根據(jù)GB4789.10-2010規(guī)定），用無菌三角推棒將菌液涂布整個平板，靜置10 min，待菌液吸收完全后，在（36±1）℃下倒置培養(yǎng)18～24 h。

以上3組試驗各進行10次平行測定，同時用無菌生理鹽水做空白對照，培養(yǎng)后觀察結果。

2.1.3結果判定計數(shù)在BP平板上菌落直徑為2～3 mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，其外層有一透明圈，用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣硬度的菌落。記錄具有該典型特征的金黃色葡萄球菌的菌落數(shù)。

2.2樣本標準值的檢測

本標準物質冷凍干燥后的脫水率為17.57%，凍干后的質量約為2 g，根據(jù)標準物質凍干前后的質量差，吸取7 mL無菌水對凍干物質進行溶解復原。檢測步驟如下：

1）用酒精棉球擦拭凍干瓶丁基膠塞，待凍干物恢復至室溫后檢測；

2）用鑷子取下丁基膠塞，倒置放于桌面；

3）加入7 mL無菌水對凍干物進行溶解，靜置2 min；

4）加入9 mL無菌水，蓋上丁基膠塞，于渦旋儀上高速混勻1 min，制成體積比1∶2的菌懸液原液；

5）用鑷子取下丁基膠塞，倒置放于桌面，用平頭移液管吸取1 mL菌懸液原液注于盛有9 mL無菌生理鹽水的試管中，旋好試管蓋后于渦旋儀上高速混勻10 s，制成10-1的菌懸液，依次制備10-2的菌懸液；

6）分別吸取上述10-1、10-2的菌懸液進行計數(shù)。

標準值檢測方式根據(jù)2.1項試驗結果決定。

2.3標準物質不確定度評定

2.3.1金黃色葡萄球菌菌落總數(shù)測定的不確定度評估隨機抽取15份樣品，每份樣品作2個平行測試，按照2.1試驗選擇的計數(shù)方法，對這些樣品進行菌落計數(shù)，再利用貝塞爾計算公式計算出檢測結果對數(shù)值標準偏差合并樣本的標準差，從而計算出不確定度。

2.3.2標準物質的定值方法不確定度評估根據(jù)對標準物質均勻性不確定度的評估結果，對標準物質定值方法進行不確定度評估。所用的評估方法與金黃色葡萄球菌菌落總數(shù)測定的不確定度評估相同。

2.3.3電子天平的不確定度評估電子天平不確定度評估的參考測量依據(jù)：JJG99-2006《砝碼檢定規(guī)程》；JJG1036-2008《電子天平檢定規(guī)程》；JJF1059-1999《測量不確定度評定與表示》。電子天平計量誤差包括重復性誤差、線性誤差和四角誤差3項。

試驗過程采用德國制Satorius BS200S-WEI電子天平，最大量程為310 g，測量分度d=1 mg，檢定分度e=10 mg，線性誤差△i=2 mg，四角誤差△c=1 mg。本次試驗所用砝碼為加載最大標準砝碼值100 g的F1等級。

3　結果與分析

3.1不同金葡菌計數(shù)方式的比較

采用PCA計數(shù)法（A組）、Baird-Parker傾注法（B組）、Baird-Parker平板涂布法（C組）3種計數(shù)方法，對含菌量相同的金葡菌樣液進行計數(shù)，結果如表1所示。

表1　金葡菌3種計數(shù)方式的對比結果Table 1　Comparison results of the S.aureus count methods

對試驗所得結果進行方差分析，分析結果見表2。

表2　方差分析結果Table 2　Results of analysis of variance

從表2可以看出，對3種不同計數(shù)方法所得數(shù)據(jù)進行方差分析，結果如下：BP傾注法用于計數(shù)金黃色葡萄球菌，其計數(shù)結果與細菌總數(shù)測定一致，且從SD值來看，BP平板傾注法小于BP平板涂布法，表明采用BP平板傾注法計數(shù)金黃色葡萄球菌的結果精密度、再現(xiàn)性較好，有利于試驗結果的復現(xiàn)。據(jù)此，BP傾注法相比于BP平板涂布法具有操作簡便、結果穩(wěn)定、再現(xiàn)性好的特點。本試驗中所涉及金黃色葡萄球菌計數(shù)均采用BP傾注法。

3.2樣本標準值的檢測結果

抽檢的樣品于同一時間同一試驗條件下進行檢測。試驗結果及統(tǒng)計結果如表3所示。

表3　標準物質中金葡菌的含量Table 3　S.aureus content in Reference Material

由表3結果計算得試驗用標準物質樣本的標準值為（279+275+273+273+276）/5=275 CFU/瓶。

3.3樣本不確定度的評估結果

3.3.1金黃色葡萄球菌計數(shù)方法的不確定度評定結果取不同批次的10份樣品進行檢測，每份樣品平行測定2次，共進行20次菌種計數(shù)的檢測，檢測結果見表4。

表4　計數(shù)方法不確定度的檢測結果Table 4　Uncertainty result of count methods

根據(jù)公式

計算每個樣品檢測結果的殘差值υi，并進一步計算樣品檢測結果的殘差平方υi2及殘差平方和Συi2，計算結果見表5。

表5　檢測結果的殘差平方Table 5　Test results of residual square

根據(jù)貝塞爾計算公式

可計算出檢測結果對數(shù)值標準偏差合并樣本的標準差Sp=0.053。式（2）中，m為檢測的樣本數(shù)，即m= 10；n為每個樣品重復檢測的次數(shù)，即n=2。

按公式

取置信水平95%，v（自由度）=10，經(jīng)過查t分布表得：t0.05（10）=2.228；得出U=2.228×0.038=0.084。

當檢測結果以2次測量對數(shù)值的平均值表示時，其值區(qū)間分布于±0.084之間。這個取值區(qū)間適合于任何一次測量。由于菌落計數(shù)結果以整數(shù)表示，因此該不確定度可忽略不計。

3.3.2金黃色葡萄球菌標準物質定值方法的不確定度評定結果取不同批次的凍干標準物質10份，每份樣品平行測量3次，計數(shù)結果見表6。

表6　定值方法的計數(shù)結果Table 6　Result of fixed-value method of counting

當測量檢驗結果用3次測量值平均值表示結果時，其值分布區(qū)間在±6之間。這個取值的區(qū)間適用于每一次測量。

3.3.3電子天平的不確定度評估電子天平不確定度的評估結果見表7。

表7　電子天平不確定度的評估結果Table 7　Results of Evaluation of the Uncertainty which is from Electronic Balance

1）四角誤差的標準不確定度Uc評估：四角誤差的標準測量結果不確定度應該按照正態(tài)分布情況考慮。在置信水平為95%時，包含誤差因子k=3；因此四角誤差的標準測量結果不確定度為

評估結果為Uc=1/3=0.33 mg

2）線性誤差的標準不確定度UL評估：UL的計算公式為

式（7）中，電子天平線性誤差Ui屬于B類的不確定度，該測量值服從均勻性分布，為

而UA為使用最大量程加載砝碼（100 g）標準時的不確定度，

在置信水平為95%，自由度Vf足夠時，式中δ為砝碼量測允許誤差值0.5，包含誤差k=3，則

3）重復性誤差測量結果的標準不確定度Ur評估：重復性誤差

計算得△r=155.005-155.004=0.001 g

當n=9，其測量值接近正態(tài)分布的前提下，每次測量結果的試驗標準差

表8　極差系數(shù)C及自由度Table 8　　Terrible coefficient C and degrees of freedom

4）合成標準不確定度U：合成標準不確定度

計算得U=1.425 2mg。

自由度

式（13）中，Uc的Vf足夠大記為∞；UL的Vf足夠大記為∞；根據(jù)表8極差系數(shù)C及自由度，當n=9時，Vf=6.8，則Veff=346。

5）擴展不確定度U：擴展不確定度

置信水平為95%時由JJG 1059-1999附錄A得包含因子k=1.96，而u=1.425 18。因此，本試驗用的電子天平的擴展不確定度為U=1.96×1.425 18= 2.793 4 mg，在本標準制備中可忽略不計。

由以上結果可知，本試驗標準物質樣本的定值結果為（275±6）CFU/瓶。

4　結語

標準物質的定值表示為：標準值±不確定度。本試驗中對樣品的標準值的計數(shù)選用了BP平板傾注法，其結果精密度、再現(xiàn)性較好，有利于試驗結果的復現(xiàn)。此外，計數(shù)時，由于金葡菌在BP平板上的菌落特征明顯，因此在很大程度上降低了操作人員的計數(shù)誤差。對整個定值過程進行了不確定度的分析，包括了金葡菌計數(shù)的不確定度（0.084）、標準值計算的不確定度（6），以及電子天平的不確定度（2.793 4）。由于菌落數(shù)為整數(shù)，最小值為0，而標準物質的質量單位為g，因此金葡菌計數(shù)的不確定度以及電子天平的不確定度在本標準物質定值中可忽略不計。

本試驗中使用的標準物質的定值方法及不確定度的評估方案適用于標準物質的定值和不確定度的測定，可作為判斷制備成果適用性的理論依據(jù)，給同類制作工藝提供了參考。

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Discussion About the Fixed Value Method of Staphylococcus aureus Reference Materials

ZHENG Jie1，KE Lu1，2，ZHANG Wenlin1，2，DAI Xiaoli1，2，YANG Weiwei3，ZHENG Jin1，2
（1.Technology Center，F(xiàn)ujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，F(xiàn)uzhou 350003，China；2.Fujian Provincial Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research，F(xiàn)uzhou 350003，China；3.Animal Science College，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350001，China）

To quantify the SD value of Staphylococcus aureus Reference Materials in chicken matrix，the S.aureus counting methods，the standard values and the uncertainty were analyzed in this study.As compared to the results of three different S.aureus counting methods，BP pouring counting method showed the same result with PCA counting method，The SD value of BP tablet pouring method was smaller as compared to BP tablet coating method.The BP tablet pouring counting showed good precision and reproducibility.The SD values was 275 CFU/bottles and the total uncertainty was 6，the Reference Materials constant value was（275+6）CFU/bottle.

Staphylococcus aureus，reference materials，fixed value，uncertainty

TS 201.6

A

1673—1689（2015）09—0972—06

2014-09-01

國家質檢總局科技計劃項目（2012IK149）。

鄭潔（1981—），女，青海西寧人，高級工程師，主要從事分析化學研究。E-mail：2210646@qq.com

鄭晶（1973—），女，福建福州人，理學碩士，研究員，主要從事食品微生物檢測及其研究。E-mail：fjciqzj@qq.com