云南省蚊媒病毒分離物的初步鑒定*

趙秋敏 郭曉芳， 左曙青 周紅寧 張久松**

(1. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071； 2. 云南省寄生蟲病防治所，云南普洱665000)

蟲媒病毒(Arthropod-borne virus, arbovirus)是一類由吸血節(jié)肢動(dòng)物傳播能引起人畜疾病的病毒,主要引起腦炎、肝炎、出血熱、關(guān)節(jié)炎等嚴(yán)重癥狀(自登云等,1995)。迄今為止已發(fā)現(xiàn)的蟲媒病毒多達(dá)550余種，其中130余種對(duì)人、畜有致病作用(Gaoetal., 2010)。國(guó)內(nèi)對(duì)蟲媒病毒的研究起步較晚，目前被證實(shí)有人間流行的蟲媒病毒僅有5種，它們是流行性乙型腦炎病毒、森林腦炎(春夏季腦炎)病毒、新疆出血熱病毒、登革病毒1～4血清型及新布尼亞病毒。我國(guó)幅員遼闊，地理景觀復(fù)雜，地跨寒、溫、熱三帶，存在多種媒介昆蟲和宿主，應(yīng)有多種蟲媒病毒存在的可能。近20年來，我國(guó)加強(qiáng)了對(duì)蟲媒病毒自然疫源地調(diào)查和病原體分離工作，特別是在蚊傳蟲媒病毒的分離與鑒定方面取得了一定的進(jìn)展，獲得了近20種新的病毒株(Gaoetal., 2010)。云南省位于我國(guó)的西南部，屬熱帶、亞熱帶氣候，物種多樣，生態(tài)環(huán)境復(fù)雜。為增加對(duì)該地區(qū)蟲媒病毒的了解，我們于2007～2011年在云南省西部地區(qū)開展了蚊媒病毒的調(diào)查研究，分離到多株病毒，其中5株初步鑒定為蓋塔病毒(Getah virus, GETV)，結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 蚊蟲標(biāo)本的采集與分離

2007～2011年在云南省從野外采集蚊蟲標(biāo)本，同一采集時(shí)間、地點(diǎn)、蚊種按50～100只分為一組，置于預(yù)冷的玻璃研磨器內(nèi)。加入1 mL RPMI-1640培養(yǎng)液研磨制成勻漿，4℃,12 000 r/min離心30 min。取上清接種白蚊伊蚊C6/36細(xì)胞，吸附1 h后，棄上清，加入9 mL細(xì)胞維持液，置于28℃培養(yǎng)箱。每日觀察細(xì)胞病變情況，盲傳3代，出現(xiàn)規(guī)律性病變者即為分離陽性。

1.2 病毒株及其增殖

將5株GETV分離物GETV-A87-09、GETV-A123-09、GETV-A132-09、GETV-A134-09和GETV-A137-09(GenBank 登錄號(hào)KP900941～KP900945)(除GETV-A123-09分離自中華按蚊Anophelessinensis，其余均來自三帶喙庫(kù)蚊Culextritaeniorhynchus在生物安全柜中打開，取100 μL用細(xì)胞維持液稀釋至1 mL，加至單層白蚊伊蚊C6/36細(xì)胞中吸附1 h，補(bǔ)加9 mL細(xì)胞維持液，置32℃、5% CO2條件下培養(yǎng)5～7 d，收集培養(yǎng)上清液，用于細(xì)胞敏感性試驗(yàn)和RT-PCR檢測(cè)。

1.3 細(xì)胞敏感性試驗(yàn)

選擇GETV-A87-09作為代表株，分別接種C6/36細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(Vero)、金黃地鼠腎細(xì)胞(BHK-21)及狗腎細(xì)胞(MDCK)，倒置顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。同時(shí)，進(jìn)行組織半數(shù)感染量(TCID50)測(cè)定(李鐘鐸，2002)。

1.4 病毒分離物RT-PCR與核苷酸序列測(cè)定

取病毒感染的C6/36細(xì)胞上清液，采用RNA提取試劑盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit，QIAGEN公司)，按照說明書提取病毒RNA，加入隨機(jī)引物合成cDNA。然后，以合成的cDNA為模板，用甲病毒屬通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(Wangetal.，2011)。上游(M2w，164～186 bp)和下游(cMw3，568～597 bp)引物序列分別為：(CT)AG AGC (AGT)TT TTC GCA(CT)(GC)T (AG)GC (ACT)(AT)和ACA T(AG)A AN(GT) GNG TNG T(AG)T C(AG)A ANC C(AGT)A (CT)CC，編碼部分甲病毒RNA依賴的 RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)。反應(yīng)體系包括：H2O 20.8 μL，10×PCR Buffer 3 μL，1 mmol/L dNTP Mixture 3 μL，上游引物(10 pmol/μL) 1 μL，下游引物(10 pmol/μL)1 μL，Tag酶0.2 μL(5 U/μL)，cDNA模板1 μL。擴(kuò)增條件為94℃ 3 min；94℃ 30 s，50℃ 60 s，72℃60 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物約為434 bp。PCR產(chǎn)物送北京諾賽基因組研究中心有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)分析。

1.5 序列與系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用DNAStar軟件進(jìn)行病毒核苷酸序列同源性分析。參考國(guó)際病毒分類委員會(huì)(ICTV)公布的第9版病毒分類報(bào)告，從基因庫(kù)中選出16株病毒作為系統(tǒng)進(jìn)化分析的參考序列，主要包括蓋塔病毒6株及已發(fā)現(xiàn)的甲病毒科病毒株，詳細(xì)情況由表1所示。采用Mega 5.0軟件最大似然法(Maximum-likelihood)構(gòu)建病毒系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 病毒的細(xì)胞敏感性

用GETV-A87-09病毒株接種上述4種傳代細(xì)胞，除MDCK細(xì)胞外，其他3種細(xì)胞均出現(xiàn)規(guī)律性CPE。病毒在C6/36細(xì)胞出現(xiàn)CPE的時(shí)間為48～72 h，以細(xì)胞皺縮、脫落、細(xì)胞間隙增大為特征(圖1)，病毒的TCID50滴度較高為6.5；在Vero細(xì)胞上，接種后24～48h出現(xiàn)CPE, 以細(xì)胞皺縮、脫落、胞內(nèi)顆粒變粗為特征, TCID50為4.0；在BHK-21細(xì)胞上，出現(xiàn)CPE的時(shí)間24～48h，以細(xì)胞腫脹、梭狀，細(xì)胞單層拉開為特征, TCID50為3.0。

圖1 病毒對(duì)C6/36、Vero及BHK-21細(xì)胞的致細(xì)胞病變作用(×100)Fig.1 Cytopathic effect induced by GETV-A87-09 strain on C6/36, Vero and BHK-21 cells (original magnification ×100)1.病毒感染C6/36細(xì)胞; 2. 正常C6/36細(xì)胞; 3. 病毒感染Vero細(xì)胞; 4. 正常Vero細(xì)胞; 5. 病毒感染BHK-21; 6. 正常BHK-21細(xì)胞。1.Virus-infected C6/36 cells; 2. Normal C6/36 cells; 3. Virus-infected Vero cells; 4. Normal Vero cells; 5. Virus-infected BHK-21 cells; 6. Normal BHK-21 cells

2.2 新分離株核苷酸序列分析

經(jīng)BLAST比對(duì)，新分離物核苷酸序列與GETV同源性最高。5株病毒與GETV中國(guó)云南YN0540株、河北株HB0234、韓國(guó)株、海南株M1及LEIV17741MPR株的同源性分別為97.9%～99.0%、97.2%～98.2%、97.9%～99.0%、97.2%～99.2%及97.2%～98.2%，與鷺山病毒(Sagiyamavirus, SAGV)的同源性為96.4%～97.4%(表2)。5株病毒之間的同源性為98.4%～100%。

表1 系統(tǒng)進(jìn)化分析中所用的病毒株及其序列信息Tab. 1 Information of reference sequences used in phylogenetic analysis in this study

表2 新分離病毒株核苷酸序列同源性 (%) 比較Tab. 3 Nucleotide sequence homology (%) among the new isolates and reference GETV strains

2.3 新分離株系統(tǒng)進(jìn)化分析

系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，5株新分離株基因序列與GETVYN0540株、HB0234株及韓國(guó)株親緣關(guān)系最近，其次為L(zhǎng)EIV17741MPR株、M1株及SAGV。這些毒株與GETV LEIV16275Mag株聚在一群(圖2)。

圖2 基于GETV部分非結(jié)構(gòu)蛋白1基因片段的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis based on the partialnon-structural protein 1 gene sequences病毒株及其序列信息請(qǐng)參見表1。Strains and their sequence information are shown in Tab. 1

3 討論

GETV屬于披膜病毒科、甲病毒屬、西門利克森林病毒復(fù)合群成員，能在各種脊椎動(dòng)物和節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi)增殖(自登云等,1995)。1955年首次在馬來西亞采集的一組白雪庫(kù)蚊中分離到GETV(Moritaetal.，1984)。已證實(shí)該病毒可引起豬、馬等家畜的疾病，在人引起的疾病只限于發(fā)熱。血清流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，GETV在歐亞大陸至東南亞、遠(yuǎn)到東亞、太平洋島嶼及澳大利亞等地區(qū)都有分布(Fuknaqaetal.，2000)。

我國(guó)1964年于海南省(Lietal.，1992)首次分離到GETV，近年來又在多個(gè)地區(qū)，包括云南(Wangetal.，2011)、河北(王煥琴等，2006；梁勇等，2010)、上海(Zhaietal.，2008)、甘肅(翟友剛等，2008)等采集的蚊蟲標(biāo)本中分離到該病毒，表明該病毒在我國(guó)分布較為廣泛。此外，20世紀(jì)90年代對(duì)南方11個(gè)地區(qū)進(jìn)行的調(diào)查結(jié)果表明，人群血清中GETV抗體的陽性率為0.18%(方美玉等，2003)。本研究獲得的病毒分離物可使C6/36、Vero及BHK-21細(xì)胞出現(xiàn)規(guī)律性的CPE，與此前的研究結(jié)果相一致(付士紅，2012)。5株病毒部分核苷酸序列與GETV 相似性最高，經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化分析與GETV處于同一進(jìn)化分支，進(jìn)化關(guān)系最近，證實(shí)為GETV。2005年云南省首次從中華按蚊和騷擾阿蚊分離到GETV(Zhaietal.，2008)，周曉芳等(2012)將2005年從云南省邊境采集的白蚊伊蚊分離的一株病毒分離物鑒定為蓋塔病毒。此外，河北省涉縣等地均從三帶喙庫(kù)蚊中分離出蓋塔病毒。本研究中新獲得的GETV分離物來自云南采集的三帶喙庫(kù)蚊和中華按蚊，表明云南省有多個(gè)蚊種均可攜帶該病毒。從地區(qū)分布來看，以往報(bào)告的GETV均來自于云南省南部邊境地區(qū)，本研究獲得的GETV除了云南省南部以外，在瀾滄江上游和中游地區(qū)也分離到該病毒，說明GETV在云南省廣泛分布。此外，新分離物均采用甲病毒通用引物被確定，可為今后蟲媒病毒的調(diào)查與鑒定提供借鑒。

我國(guó)對(duì)GETV的研究報(bào)告不多，對(duì)其媒介和宿主的分布情況尚不清楚，對(duì)人群的危害程度亦不知，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)研究。