旋毛蟲Hsp70與Ts87融合蛋白的構建表達及鑒定*

孫 靚 孫 青 房 磊 楊 靜 顧 園 畢 闊 諸欣平

(首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體寄生蟲學教研室，北京 100069)

旋毛蟲病是一種人獸共患的寄生蟲病，人或動物通過生食或半生食含旋毛蟲囊包幼蟲的豬肉或其他肉類而感染。旋毛蟲病呈世界性分布，在歐洲、北美洲、阿根廷、老撾、中國等地都有流行(Pozio, 2007；Murrelletal., 2011; Feidasetal., 2014)。我國是世界上受旋毛蟲病危害較嚴重的國家之一，近年來由于生食、涮、烤等食肉方式的多樣化，加之人們越來越多地嘗試食用野生動物肉類，使得我國旋毛蟲病發(fā)病率呈上升趨勢(Murreletal., 2011; 魚艷榮等，2013； 劉明遠等，2014)。因此預防和控制旋毛蟲病的傳播和流行是一個亟待解決的問題，而目前尚無十分有效的預防旋毛蟲病的疫苗問世。

本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，從旋毛蟲成蟲cDNA表達文庫中篩選得到的排泄分泌蛋白rTs87有著較好的免疫原性。通過肌注rTs87蛋白與佐劑的混合物可誘小鼠體產生體液和細胞免疫反應，通過灌胃的方式可誘導產生粘膜免疫反應，并且以其制備DNA疫苗的肌幼蟲減蟲率可達40%以上(Yangetal., 2010; Yangetal., 2013)。旋毛蟲熱休克蛋白70(Ts-Hsp70)是我們從旋毛蟲成蟲cDNA表達文庫中克隆表達的另一種蛋白，我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)該蛋白為可溶蛋白，可以通過活化樹突狀細胞(DC)誘導機體產生較強的抗旋毛蟲感染的免疫保護作用(Wangetal., 2009; Fangetal., 2014)。然而，單一蛋白免疫的效果并不十分理想。

融合蛋白是將兩個或多個基因通過DNA重組的技術相連接，獲得具有多種蛋白質功能的表達產物(Schmidt, 2013)。由于其相對分子質量較大，抗原表位多，更容易誘導較強烈的免疫反應(Chengetal., 2014; Pieczykolanetal., 2014)。同時，聯(lián)合使用兩種或多種蛋白疫苗，可以發(fā)揮協(xié)同促進功能產生更好的免疫效果(Juteletal., 2014)。為研制更為有效的抗旋毛蟲感染的疫苗，本研究將旋毛蟲Ts-Hsp70與Ts87基因連接重組，誘導表達融合蛋白，并進行鑒定，為研制更高效的旋毛蟲疫苗奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物：BALB/c雌性小鼠，6～8周齡，購自中國軍事醫(yī)學科學院。

1.1.2旋毛蟲蟲株：ICR鼠傳代保存的黑龍江豬源旋毛蟲Trichinellaspiralis。

1.1.3質粒與菌株：質粒pET-28a(+)和E.coli菌株BL21(DE3)、DH5α由本室保存。

1.1.4主要試劑：Taq酶、限制性內切酶、DNA連接酶，購自Takara生物有限公司；卡那霉素購自北京華美生物工程有限公司；IPTG購自Sigma公司；His-Bind試劑盒、Protein Refolding試劑盒購自Novagen公司；His標簽鼠源單抗購自冠星宇科技有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗小鼠IgG二抗購自美國LI-COR公司。

1.2 實驗方法

1.2.1重組質粒構建：實驗室前期已成功構建pET-28a(+)/Ts-Hsp70和pET-28a(+)/Ts87質粒(楊靜等, 2003; Wangetal., 2009)。以pET-28a(+)/Ts-Hsp70為模板，以L1: 5′-G C G G A T C C A T G G T C G G T C G A G A AT-3′ (BamHⅠ)，R1: 5′-G C G A A T T C C A G T T C A T C T T T T T C T T C AG-3′ (EcoRⅠ)為引物，PCR擴增編碼Ts-Hsp70的目的基因，并連入pET28a(+)載體，構建新載體pET-28a(+)/Ts-Hsp70，導入DH5α菌株，在含有卡那霉素的LB平板上37℃過夜培養(yǎng)，選取陽性菌落PCR，并提取質粒雙酶切鑒定，測序分析。以L2: 5′-G C G A A T T C A T G T T C A T A T T T T A T G C T A T A GC-3′ (EcoRⅠ)和R2: 5′-G C C T C G A G T T A G G T G C A T G C A T C C A AG-3′(XhoⅠ)為引物，pET-28a(+)/Ts87為模板，擴增Ts87目的基因，雙酶切純化后連入pET-28a(+)/Ts-Hsp70質粒，轉化感受態(tài)細胞DH5α，同上篩選陽性克隆，菌落PCR，酶切鑒定，測序分析。

1.2.2rTs-Hsp70-Ts87融合蛋白的表達及純化：將pET-28a(+)/Ts-Hsp70-Ts87質粒導入表達宿主菌BL21(DE3)中，涂于含卡那霉素的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖菌培養(yǎng)，當菌液OD值達到0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度1 mmol/L誘導表達，4 h后收集菌體。超聲破菌，11 000 r/min, 4℃離心10 min，用含有6 mol/L鹽酸胍的Binding溶液溶解沉淀，用His-Bind試劑盒對蛋白進行純化，用Protein Refolding試劑盒對蛋白進行復性。

1.2.3免疫血清制備: 同上述方法表達和純化rTs-Hsp70、rTs87蛋白，將其分別與佐劑ISA50v2按1∶1的體積比例混合，隔周免疫1次，共免疫3次，背部皮下多點注射，每只小鼠免疫劑量為20 μg。末次免疫后7天，眼內眥靜脈取血，將血液室溫靜置2 h后，3 000 r/min離心10 min，分離上清，再重復離心一次，取上清即為免疫血清。

1.2.4rTs-Hsp70-Ts87融合蛋白的鑒定：用Western blot的方法檢測rTs-Hsp70-Ts87融合蛋白與抗His標簽單抗、rTs-Hsp70免疫血清、rTs87免疫血清的反應情況。將純化后的rTs-Hsp70-Ts87進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移至NC膜上，一抗分別用抗His單抗(用抗體稀釋液以1∶5000稀釋血清)，rTs-Hsp70免疫血清(1∶20 000)，rTs87免疫血清(1∶20 000)室溫慢搖1 h，二抗用羊抗小鼠IRDye800(抗體稀釋液1∶ 5 000稀釋)，室溫避光緩慢搖動1 h。用Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)對NC膜進行掃描成像。

2 結果

2.1 重組原核表達質粒的構建

Ts-Hsp70(1 764 bp)與Ts87(1 044 bp)基因通過EcoRⅠ酶切位點相連接，構建含有目的基因Ts-Hsp70-Ts87的表達質粒pET-28a(+)/Ts-Hsp70-Ts87。經菌落PCR、酶切鑒定和DNA序列分析，證明目的基因已成功插入表達載體，如圖1所示，箭頭所指的條帶即為Ts-Hsp70-Ts87融合基因的條帶，其分子量為2 721 bp。

圖1 pET-28a(+)/Ts-Hsp70-Ts87酶切鑒定Fig.1 Digestion identification of pET-28a(+)/Ts-Hsp70-Ts87M: DNA分子量標準; 1: pET-28a(+)/Ts-Hsp70-Ts87重組質粒單酶切; 2-3: pET-28a(+)/Ts-Hsp70-Ts87重組質粒雙酶切; 4: pET28a(+)空質粒雙酶切; 5: pET28a (+)空質粒單酶切。M: DNA marker; 1: pET-28a(+)/Ts-Hsp70-Ts87 single enzyme digestion; 2-3: pET-28a(+)/Ts-Hsp70-Ts87 double enzyme digestion; 4: pET-28a(+)double enzyme digestion; 5: pET-28a(+)single enzyme digestion.

2.2 重組蛋白rTs-Hsp70-Ts87的表達和純化

對pET-28a(+)/Ts-Hsp70-Ts87的BL21表達菌進行誘導表達及SDS-PAGE電泳分析，結果顯示，與誘導的空質粒和未誘導的重組質粒相比，誘導表達的重組質粒在約100 kDa左右可見明顯的表達條帶，與理論值相符。rTs-Hsp70-Ts87為非可溶蛋白，經鎳柱親和層析變性純化、復性后，可溶且條帶較單一，如圖2所示，箭頭所指的條帶即為目的條帶rTs-Hsp70-Ts87。

圖2 融合蛋白rTs-Hsp70-Ts87的誘導表達及純化產物的SDS-PAGE電泳分析Fig.2 Expression and purification of rTs-Hsp70-Ts87 by SDS-PAGEM: 蛋白分子量標準; 1: IPTG誘導表達的空質粒pET28a(+)全菌蛋白; 2: 未誘導表達的pET28a(+)/Ts-Hsp70-Ts87全菌蛋白; 3: IPTG誘導表達的pET28a(+)/Ts-Hsp70-Ts87全菌蛋白; 4: 純化復性后的rTs-Hsp70-Ts87融合蛋白。M: Protein marker; 1: Crude E.coli lysate control (empty vector with IPTG induction); 2: Crude E.coli lysate without induction(pET-28a(+)/Ts-Hsp70-Ts87); 3: Crude E.coli lysate with IPTG induction(pET-28a(+)/Ts-Hsp70-Ts87); 4: Purified and refolded fusion protein rTs-Hsp70-Ts87.

圖3 Western blot鑒定rTs-Hsp70-Ts87Fig.3 Western blot analysis of rTs-Hsp70- Ts87M: 蛋白分子量標準; 1: rTs-Hsp70- Ts87與抗His單抗相結合; 2:與rTs-Hsp70免疫血清相結合; 3: 與rTs87免疫血清相結合。M: Protein marker; 1: rTs-Hsp70- Ts87 recognized by anti-His MAb; 2: rTs-Hsp70- Ts87 recognized by rTs-Hsp70 immune sera; 3: rTs-Hsp70- Ts87 recognized by rTs87 immune sera.

2.3 重組蛋白rTs-Hsp70-Ts87的鑒定

用Western blot的方法對融合蛋白rTs-Hsp70-Ts87進行鑒定結果見圖3。用抗His標簽單抗檢測重組蛋白表達，結果在100 kDa左右出現(xiàn)明顯的蛋白印跡帶，該蛋白的理論分子量與表達載體所攜帶的His標簽的分子量相加約為100 kDa，與實驗結果一致，提示融合蛋白表達正確。rTs-Hsp70-Ts87可分別被rTs-Hsp70免疫血清、rTs87免疫血清識別，提示該rTs-Hsp70-Ts87存在Ts-Hsp70和Ts87的抗原表位。

3 討論

融合蛋白在基因表達、多功能酶研究、定向藥物、新型細胞因子等方面均有廣泛應用(張毅等, 2000; Schmidt, 2013)。如今，融合蛋白的應用更為疾病的治療和預防帶來新的希望。免疫球蛋白IgG1的Fc段已與TNFR、CTLA-4、 LFA-3、IL-1R等組成融合蛋白作為藥物廣泛應用于臨床，對于免疫系統(tǒng)疾病如類風濕性關節(jié)炎、強直性脊柱炎、銀屑病、家族性寒冷型自身炎癥綜合征和穆-韋(Muckle-Wells)兩氏綜合征等有較好療效，且因其亞基FcγRs可作用于抗原提呈細胞調節(jié)免疫應答，也可與抗原結合用于疫苗的研究(Czajkowskyetal., 2012)。

Hsp70因其良好的免疫源性及佐劑作用被廣泛用于多種融合蛋白的構建。例如：Hsp70與漢坦病毒核衣殼蛋白相融合，形成融合蛋白HTNV，可通過提高Th1型免疫反應，達到更好的免疫效果(Lietal., 2008)；Hsp70也可與腫瘤相關抗原MAGE-A1相融合，提高抗原提呈能力，增強T細胞介導特異性免疫應答，對于表達MAGE-A1的腫瘤有高效的殺傷作用(Jiangetal., 2013)。另外，我們的前期工作證實，rTs-Hsp70可刺激樹突狀細胞成熟，提高Th1型細胞因子IFN-γ和IL-2及Th2型細胞因子IL-4和IL-6的分泌水平，與佐劑ISA50v2混合后免疫雌性BALB/c小鼠可獲41.3%的肌幼蟲減蟲率(Fangetal., 2014)，對旋毛蟲感染有良好的免疫保護效果。而rTs87作為一種旋毛蟲排泄分泌抗原同樣可以誘導較好的抗旋毛蟲免疫應答，但其作用仍需加強(Yangetal., 2010)。因此，為獲得更高效的抗旋毛蟲感染的疫苗，本研究將Ts-Hsp70與Ts87這兩種疫苗候選蛋白的基因連接重組，并誘導表達了融合蛋白rTs-Hsp70-Ts87，為后續(xù)對融合蛋白rTs-Hsp70-Ts87免疫保護性的研究奠定了基礎。

Hsp70基因有3個結構域，從N端到C端分別為核酸結合區(qū)，多肽底物結合區(qū)和可變區(qū)結構，前兩者較為保守，是發(fā)揮其幫助蛋白質折疊和佐劑作用的關鍵區(qū)域(Kiangetal., 1998)。因而在構建融合蛋白的過程中通常將Hsp70置于N端，本研究依據這一特點，在構建表達質粒的過程中，將Ts-Hsp70連接于N端形成融合基因Ts-Hsp70-Ts87，這樣有助于保留Ts-Hsp70協(xié)助蛋白質折疊的功能和其佐劑的作用。中間的連接采用EcoRⅠ酶切位點，該酶切位點表達谷氨酸和苯丙氨酸，對于整體蛋白的表達、折疊、抗原表位的形成影響不大(Lietal., 2008; Jiangetal., 2013)。

融合蛋白的構建方法主要有重疊延伸PCR、限制性內切酶酶切位點連接兩種方法(閆璐穎等, 2008)。重疊延伸PCR法運用具有互補末端的引物，產生具有重疊序列的PCR產物，并將產物通過PCR的方式進行拼接(Yuanetal., 2012)，此法多用于短片段和含有中間連接肽的融合蛋白的構建。限制性內切酶酶切位點連接利用限制性內切酶酶切位點將兩個基因連接融合(Lietal., 2008)。此外，Invitrongen 公司開發(fā)的Gateway方法和Clontech公司研發(fā)的Infusion技術理論上均可應用于融合蛋白的制備，但由于成本較高，且中間需要插入不同大小的肽段，目前應用較少。本研究曾多次嘗試運用重疊延伸PCR的方法進行目的片段的連接但均未成功，可能是由于Ts-Hsp70與Ts87片段較大且Ts87片段兩端序列不太適宜引物的合成。隨后我們改用限制性內切酶酶切位點連接法進行融合基因的構建，采用的酶切位點為EcoRⅠ酶切位點，經多次條件優(yōu)化，最終成功將兩個目的片段進行連接。上述結果提示，在對兩種或兩種以上已知序列的長片段基因進行連接時，宜選用限制性內切酶酶切位點連接的方法，且與PCR拼接法相比，此方法也更為經濟快捷。

在融合蛋白的誘導表達過程中，本實驗采用大腸埃希菌原核表達系統(tǒng)，所表達的融合蛋白為非可溶性蛋白，經純化復性后可得到少量可溶蛋白。在前期研究中，大腸埃希菌原核表達系統(tǒng)表達出的蛋白rTs-Hsp70為可溶蛋白，rTs87為不可溶蛋白；二者融合后，分子量較大，可能是導致其不可溶的主要原因。另外，為提高蛋白表達量，我們探索了不同IPTG誘導劑濃度及不同誘導時間對于蛋白表達的影響，結果發(fā)現(xiàn)本實驗中IPTG誘導劑濃度及誘導時間對蛋白表達無明顯影響，因此后期實驗仍采用實驗室常規(guī)IPTG濃度及時間進行誘導表達。今后也可嘗試酵母表達系統(tǒng)、昆蟲表達系統(tǒng)對融合蛋白的表達進行優(yōu)化。rTs-Hsp70-Ts87的Western鑒定結果發(fā)現(xiàn) rTs-Hsp70-Ts87可被抗His標簽單抗、rTs-Hsp70免疫血清、rTs87免疫血清識別，表明我們成功構建了融合蛋白rTs-Hsp70-Ts87，且此蛋白同時具有Ts-Hsp70和Ts87的抗原表位，可用于后續(xù)研究。

綜上所述，本研究利用基因重組技術首次將旋毛蟲的兩種抗原分子Ts-Hsp70和Ts87的編碼基因進行融合構建，并應用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)成功誘導表達了該融合蛋白。此項工作為進一步探討旋毛蟲抗原融合蛋白的免疫保護性，及其作為疫苗候選抗原的可能性奠定了基礎，并且為研制新型旋毛蟲病疫苗提供了新的方向。