白地霉發(fā)酵過程中菌體量檢測方法的研究

張良雨，趙強(qiáng)強(qiáng)，郝靈珍，劉祝兵，管　　斌，*，孔　青，范金石

（1．中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003；2．青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島266042）

白地霉發(fā)酵過程中菌體量檢測方法的研究

張良雨1，趙強(qiáng)強(qiáng)1，郝靈珍1，劉祝兵2，管斌1，*，孔青1，范金石2

（1．中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003；2．青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島266042）

探討了白地霉發(fā)酵過程中菌體量的檢測方法，對白地霉的細(xì)胞組分麥角固醇和氨基葡萄糖，能否作為菌體量檢測指標(biāo)的可行性進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明：氨基葡萄糖在白地霉細(xì)胞中的含量較為穩(wěn)定，在不同的培養(yǎng)時間、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基中都有較好的穩(wěn)定性，可以作為白地霉菌體量的檢測指標(biāo)；麥角固醇受培養(yǎng)時間和培養(yǎng)基成分的影響較大，含量不穩(wěn)定，不太適合作為白地霉菌體量的檢測指標(biāo)。用氨基葡萄糖法測得的白地霉生長曲線與用干重法測得的生長曲線變化一致，能夠較為準(zhǔn)確地反映白地霉菌體量變化。將此方法應(yīng)用到白地霉固態(tài)發(fā)酵中，可快速得到白地霉固態(tài)發(fā)酵過程中的菌體量變化，為以后固態(tài)發(fā)酵菌體量的測定提供了依據(jù)。

白地霉，菌體量，麥角固醇，氨基葡萄糖

白地霉（Geotrichum candidum）是一種常見真菌，形態(tài)特征介于酵母菌和霉菌之間，繁殖方式以裂殖為主，少數(shù)菌株間有芽生孢子。菌落呈絨毛狀或粉狀，韌或易碎，具有真菌絲，芽孢子單個或連接成鏈，長筒狀，也有些呈橢圓形［1］。白地霉生長適應(yīng)性強(qiáng)，生長快，在多種介質(zhì)中均能生長，菌體蛋白含量豐富，可用于優(yōu)質(zhì)的蛋白飼料及脂肪酶的發(fā)酵生產(chǎn)等。

菌體量是反映微生物生長情況的一項(xiàng)基本參數(shù)，通過測定其菌體量可了解發(fā)酵過程中微生物的生長及發(fā)酵狀況。與液態(tài)發(fā)酵相比，固態(tài)發(fā)酵具有投資少，易操作，后處理簡單，污染少，生長粗放，產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，因此受到國內(nèi)外人士的廣泛青睞，成為發(fā)酵行業(yè)中廣泛應(yīng)用的工藝類型之一。但白地霉，在固態(tài)基質(zhì)中生長時，菌絲會深入培養(yǎng)基內(nèi)部，與培養(yǎng)基緊密纏繞在一起，不易從底物中分離出來，所以很難直接測定其菌體量。為解決這一難題，通常采用間接法來進(jìn)行微生物菌體量的測定。固態(tài)發(fā)酵中測定微生物菌體量的方法大致可分為以下4大類：a.直接從固態(tài)培養(yǎng)基中將菌體分離出來進(jìn)行測定，如：直接計(jì)數(shù)［2］等；b.檢測細(xì)胞的代謝成分變化，如測定O2和CO2的代謝量［3-4］、測定胞外酶的活性［5］、測定ATP［6］、免疫活性等；c.測定營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，如干重?fù)p失法［7］等；d.測定細(xì)胞中的某些特殊組分，如幾丁質(zhì)［8］、核酸［9］和蛋白質(zhì)等。

目前國內(nèi)外有關(guān)白地霉液態(tài)以及固態(tài)發(fā)酵菌體量的測定方法報道較少，綜合對液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵生物量的研究結(jié)果，選用文獻(xiàn)中較為準(zhǔn)確且易行的幾種方法：測定細(xì)胞中的特殊物質(zhì)如麥角固醇［10］、氨基葡萄糖［11］等組分含量來推測微生物菌體量。麥角固醇，是存在于真菌細(xì)胞膜中的甾類化合物，是真菌中主要的固醇類物質(zhì)，專一性很強(qiáng)。幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁的主要成分，是一種由N-乙酰氨基葡萄糖通過α-1，4糖苷鍵連接而成的直鏈高分子聚合物。本文通過研究白地霉菌體內(nèi)麥角固醇和氨基葡萄糖含量與菌體量之間的關(guān)系，考察了培養(yǎng)時間、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分對其含量的影響，力求確定一種操作簡便、快速準(zhǔn)確的測定白地霉菌體量或反映白地霉生長狀況的方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

白地霉（編號：2.0498 Geotrichum candidum） 中國微生物菌種保藏中心；菌種保藏培養(yǎng)基10°Brix麥芽汁1000mL，瓊脂20g，pH6.0；液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)基Ⅰ：葡萄糖10g，MgSO4·7H2O 1g，KH2PO45g，酵母浸膏2g，尿素1g，加水定容至1L，pH6.0；培養(yǎng)基Ⅱ：10°Brix麥芽汁1000mL，pH6.0；固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基處理秸稈∶麩皮∶豆粕=6∶3∶1，固液比1∶1.5；麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液、氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液用Sigma公司提供的標(biāo)準(zhǔn)品配制；醇堿溶液50%KOH：無水乙醇（體積比2∶3）；正庚烷分析純；乙酰丙酮試劑3.5mL乙酰丙酮溶于50mL 1.2mol/L碳酸鈉溶液中，現(xiàn)用現(xiàn)配；對二甲氨基苯甲醛試劑1.333g對二甲氨基苯甲醛溶于25mL無水乙醇及25mL濃鹽酸的混合液中，棕色瓶保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

SPS202F型電子分析天平梅特勒-托利多稱重設(shè)備有限公司；ZDX-35BI型高壓蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；DH4000AB型電熱恒溫培養(yǎng)箱、DL-I-15型高級臺式封閉電爐天津市泰斯特儀器有限公司；SHZ-C型水浴恒溫振蕩器上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；HWS-250型恒溫恒濕箱、DZF-6020型真空干燥箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵鞏義市英峪予華儀器廠；PHS-2F型pH計(jì)、722N型可見分光光度計(jì)上海精科電子有限公司；BCM-1000型超凈工作臺蘇凈集團(tuán)安泰公司；LD5-10B型低速離心機(jī)北京雷勃爾離心機(jī)有限公司；UV-2802PC型紫外分光光度計(jì)尤尼克儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌種培養(yǎng)方法斜面種子培養(yǎng)：將保存的白地霉菌種接入斜面麥芽汁培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)至菌苔長滿斜面，置冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)：用生理鹽水沖洗斜面，并稀釋至孢子濃度為106～107cfu/mL（血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)）。在300mL三角瓶中加入100mL液體培養(yǎng)基Ⅰ，115℃滅菌30min后，接入白地霉孢子懸浮液5mL，30℃、180r/min恒溫振蕩培養(yǎng)48h。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)：在500mL三角瓶中加入固態(tài)培養(yǎng)基20g，滅菌后接入白地霉液體種子液2mL，30℃下恒溫靜置培養(yǎng)，每天搖動三角瓶以防止結(jié)塊。

1.2.2純菌絲體的獲得培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液抽濾，并用蒸餾水充分洗滌濾紙上的濾出物，收集濾出物，然后置60℃真空干燥箱內(nèi)烘干至恒重，研缽研碎，置于干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.2.3.1麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確配制濃度為100μg/mL的麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋成梯度溶液，用紫外分光光度計(jì)測其282nm處吸光值，繪制麥角固醇濃度與吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確配制濃度為100μg/mL的氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋成梯度溶液，各取2mL樣液（空白為蒸餾水），分別加入1mL乙酰丙酮試劑，沸水浴30min，冷卻后加入2mL無水乙醇、1mL對二甲氨基苯甲醛試劑振蕩，再加入4mL無水乙醇，60℃保溫1h，用可見分光光度計(jì)測其530nm處吸光值［12］，繪制氨基葡萄糖濃度與吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4微生物菌體量與麥角固醇以及氨基葡萄糖含量的關(guān)系

1.2.4.1菌體中麥角固醇含量與菌體量的關(guān)系準(zhǔn)確稱取在同一培養(yǎng)條件下培養(yǎng)相同時間所得到的純菌體0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g，提取菌體中的麥角固醇并測其吸光值，計(jì)算不同質(zhì)量菌體中麥角固醇的含量。

1.2.4.2菌體中氨基葡萄糖含量與菌體量的關(guān)系準(zhǔn)確稱取在同一培養(yǎng)條件下培養(yǎng)相同時間所得到的純菌體0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g，提取菌體中的氨基葡萄糖并測其吸光值，計(jì)算不同質(zhì)量菌體中氨基葡萄糖的含量。

1.2.5培養(yǎng)條件對菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響

1.2.5.1培養(yǎng)時間對菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響將白地霉接種于液體培養(yǎng)基Ⅰ中，30℃，180r/min下培養(yǎng)，每12h進(jìn)行取樣分析，測定不同菌齡下白地霉單位菌體內(nèi)麥角固醇和氨基葡萄糖的含量。

1.2.5.2搖床轉(zhuǎn)速對菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響在液體發(fā)酵中，影響微生物生長的主要因素為培養(yǎng)過程中的溶氧量（與搖床轉(zhuǎn)速相關(guān)）［8］。為研究培養(yǎng)條件對菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響，在此選擇不同的搖床轉(zhuǎn)速作為改變的培養(yǎng)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在培養(yǎng)基Ⅰ中接種白地霉，選擇搖床轉(zhuǎn)速為160、180、200r/min，30℃培養(yǎng)48h后獲得純菌體，測定單位菌體內(nèi)麥角固醇和氨基葡萄糖的含量。

1.2.5.3培養(yǎng)基對菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響分別在培養(yǎng)基Ⅰ、培養(yǎng)基Ⅱ中接種等量的白地霉，30℃，180r/min下培養(yǎng)48h后獲得純菌絲體，測定單位菌體內(nèi)麥角固醇和氨基葡萄糖的含量。

1.2.6氨基葡萄糖含量與微生物菌體量的變化曲線

將白地霉接種于液體培養(yǎng)基Ⅰ中，30℃，180r/min下培養(yǎng)，每隔4h取樣，先通過抽濾烘干測其菌體干重，再檢測干燥后菌體中的氨基葡萄糖含量，根據(jù)氨基葡萄糖與菌體量的關(guān)系進(jìn)而推算出白地霉的菌體干重，每組實(shí)驗(yàn)做三次平行，取其平均值，通過兩種方法繪制生長曲線并比較兩條曲線的變化情況。

1.2.7白地霉固態(tài)發(fā)酵過程中菌體量的變化按10%的接種量，將液態(tài)培養(yǎng)24h的白地霉種子液接入固體培養(yǎng)基中，30℃恒溫靜置培養(yǎng)，每天提取固體培養(yǎng)基中的氨基葡萄糖含量，并計(jì)算白地霉菌體量，繪制白地霉固態(tài)發(fā)酵菌體量隨時間的變化曲線。

1.3測定方法

1.3.1麥角固醇的提取和測定按照張博潤等［13］的方法，并作出適當(dāng)修改。準(zhǔn)確稱取干菌體0.1g（空白不加）置于100mL磨口三角瓶中，加入20mL醇堿溶液，85～90℃水浴中皂化3h，室溫下冷卻，加入20mL正庚烷進(jìn)行萃取，加瓶塞振蕩30s，靜置30min分層。取上清液0.5mL，加4.5mL 95%乙醇稀釋10倍，用紫外分光光度計(jì)測定282nm處的吸光值。其單位干菌體細(xì)胞中麥角固醇的含量計(jì)算公式如下：

式中：c—根據(jù)樣品在282nm處的吸收值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中獲得麥角固醇的濃度（μg/mL）；N—稀釋倍數(shù)；V—萃取液的體積（mL）；w—菌體干重（g）。

1.3.2氨基葡萄糖的提取和測定

1.3.2.1樣品預(yù)處理［14］準(zhǔn)確稱取干菌體0.3g（干固態(tài)培養(yǎng)基0.6g），加2mL 60%H2SO4，25℃浸泡24h，稀釋至1mol/L H2SO4，置于250mL三角瓶中，9.8×104Pa高壓加熱1h，冷卻后用1mol/L NaOH中和至pH7，定容到100mL。

1.3.2.2測定方法［12］Elson-Morgan法用于測定游離的氨基糖，氨基糖在堿性條件下與乙酰丙酮縮合形成生色原——2-甲基-3-二乙酰吡咯衍生物，生色原再與對二甲氨基苯甲醛在濃鹽酸乙醇溶液中生色，在530nm處有最大吸收值。取2mL樣液（空白為蒸餾水），加1mL乙酰丙酮試劑，沸水浴加熱30min，冷卻后加入2mL無水乙醇、1mL對二甲氨基苯甲醛試劑振蕩，再加入4mL無水乙醇，60℃保溫1h，530nm處測定吸光值。其單位干菌體細(xì)胞中氨基葡萄糖的含量為：

式中：c—根據(jù)樣品在530nm處的吸收值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中獲得氨基葡萄糖的濃度（μg/mL）；V—樣液的總體積（mL）；w—菌體干重（g）。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)做三個平行，結(jié)果均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），比較數(shù)據(jù)間的差異性是否顯著，顯著水平為p＜0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1麥角固醇與氨基葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

麥角固醇含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。由此得到麥角固醇含量與光吸收值的函數(shù)關(guān)系：麥角固醇含量（μg/mL）=35.84×A282。

圖1　麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of ergosterol

氨基葡萄糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。由此得到氨基葡萄糖含量與光吸收值的函數(shù)關(guān)系：氨基葡萄糖含量（μg/mL）=113.64×A530。

圖2　氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　Standard curve of glucosamine

2.2微生物菌體量與麥角固醇以及氨基葡萄糖含量的關(guān)系

一種細(xì)胞組分能否作為微生物菌體量的檢測指標(biāo)，首要的條件就是其在細(xì)胞中的含量應(yīng)與菌體量具有良好的線性關(guān)系。因此，首先對細(xì)胞中麥角固醇、氨基葡萄糖含量與菌體量的關(guān)系進(jìn)行考察。

2.2.1菌體中麥角固醇含量與菌體量的關(guān)系由圖3可知，在同一培養(yǎng)條件下培養(yǎng)相同時間所得到的不同質(zhì)量的白地霉菌體中，麥角固醇含量與菌體量之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，所得線性回歸方程為y= 3.106x-0.0314，相關(guān)系數(shù)R2=0.9962。

表1　培養(yǎng)時間對菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響Table 1　Effect of culture time on content of ergosterol and glucosamine

圖3　菌體生物量與麥角固醇含量的關(guān)系Fig.3　Correlation between mycelia biomass and ergosterol content

2.2.2菌體中氨基葡萄糖含量與菌體量的關(guān)系由圖4可知，在同一培養(yǎng)條件下培養(yǎng)相同時間所得到的不同質(zhì)量的白地霉菌體中，氨基葡萄糖含量與菌體量之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，所得線性回歸方程為y=37.834x+0.0716，相關(guān)系數(shù)R2=0.9945。

圖4　菌體生物量與氨基葡萄糖含量的關(guān)系Fig.4　Correlation between mycelia biomass and glucosamine content

2.3培養(yǎng)條件對菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響

一種細(xì)胞組分能否作為微生物菌體量的檢測指標(biāo)，其在細(xì)胞中的含量與微生物菌體量僅有良好的線性關(guān)系還不夠，此組分在細(xì)胞中的含量還必須在微生物的整個生長周期內(nèi)基本維持恒定，即與培養(yǎng)時間無關(guān)；而且在不同的培養(yǎng)條件下基本保持相同［15］。因此，接下來從培養(yǎng)時間、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分三方面對菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的穩(wěn)定性進(jìn)行了驗(yàn)證。

2.3.1培養(yǎng)時間對菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響由表1可以看出，培養(yǎng)12h的菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量與其他數(shù)據(jù)相差較大，這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)12h時白地霉菌絲體的量很少，通過過濾法收集菌體后烘干稱重所產(chǎn)生的相對誤差較大，故可以將此組數(shù)據(jù)舍去。將其余數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表明在檢驗(yàn)水平α=0.05時，不同菌齡的白地霉單位菌體內(nèi)麥角固醇含量差異顯著（p＜0.05），而單位菌體內(nèi)氨基葡萄糖含量無顯著差異（p＞0.05），故可認(rèn)為菌齡對白地霉單位菌體內(nèi)麥角固醇含量有較大影響，而對單位菌體內(nèi)氨基葡萄糖含量影響不大。

2.3.2搖床轉(zhuǎn)速對菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響溶氧量是影響微生物生長的主要因素，通過改變搖床轉(zhuǎn)速來改變?nèi)苎趿?，探究不同培養(yǎng)條件下單位菌體內(nèi)麥角固醇和氨基葡萄糖含量的變化。將表2數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表明在檢驗(yàn)水平α=0.05時，不同搖床轉(zhuǎn)速下，白地霉單位菌體內(nèi)麥角固醇和氨基葡萄糖的含量均無顯著差異（p＞0.05），故可視作單位菌體內(nèi)麥角固醇和氨基葡萄糖含量在不同的搖床轉(zhuǎn)速下基本保持相同。

表2　搖床轉(zhuǎn)速對菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響Table 2　Effect of shaking speed on content of ergosterol and glucosamine

2.3.3培養(yǎng)基對菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響培養(yǎng)基Ⅰ是以葡萄糖為碳源，尿素為氮源，添加營養(yǎng)鹽的合成培養(yǎng)基；培養(yǎng)基Ⅱ所采用的麥芽汁培養(yǎng)基為天然培養(yǎng)基，其主要成分來源于麥芽，兩種培養(yǎng)基的組成顯然不同。將表3數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表明在檢驗(yàn)水平α=0.05時，對于不同的培養(yǎng)基組成，白地霉單位菌體內(nèi)麥角固醇含量差異較為顯著（p＜0.05），而單位菌體內(nèi)氨基葡萄糖含量無顯著差異（p＞0.05），因此可認(rèn)為培養(yǎng)基成分的不同對單位菌體內(nèi)氨基葡萄糖的含量幾乎沒有影響，而對單位菌體內(nèi)麥角固醇含量的影響則相對要大。

綜合以上三個實(shí)驗(yàn)的結(jié)果得出：氨基葡萄糖在白地霉菌體中的含量相對穩(wěn)定，與菌齡、搖床轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)基組成無關(guān)，可以作為衡量白地霉菌體量的檢測指標(biāo)；而麥角固醇雖不受搖床轉(zhuǎn)速的影響，但受菌齡和培養(yǎng)基成分的影響較大，不適合作為白地霉菌體量測定的指標(biāo)。

表3　培養(yǎng)基成分對菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響Table 3　Effect of different mediums on content of ergosterol and glucosamine

2.4氨基葡萄糖含量與微生物菌體量的變化曲線

由圖5可以看出，液體發(fā)酵后得到的白地霉純菌體，通過稱量不同培養(yǎng)時間的菌體干重繪制出來的生長曲線，與通過檢測培養(yǎng)不同時間菌體內(nèi)氨基葡萄糖含量進(jìn)而推算出的菌體干重變化趨勢一致，最大偏差為0.271g，可以認(rèn)為，菌體中氨基葡萄糖的含量能夠較為準(zhǔn)確地反映白地霉菌體量的變化。

圖5　白地霉實(shí)測菌體量和推算菌體量的變化曲線Fig.5　The changed curve of Geotrichum candidum actual biomass and calculated biomass

2.5白地霉固態(tài)發(fā)酵過程中菌體量的變化

白地霉在固態(tài)發(fā)酵過程中由于菌絲體與培養(yǎng)基纏繞在一起不容易直接測定，故在確定了其菌體量檢測方法之后，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵時，便可利用氨基葡萄糖法測定其菌體量的變化情況，結(jié)果如圖6所示。

圖6　白地霉固態(tài)發(fā)酵過程中菌體量的變化Fig.6　Mycelia development of Geotrichum candidum during solid state fermentation process

由于氨基葡萄糖是真菌細(xì)胞壁的主要成分，固態(tài)基質(zhì)中并不存在氨基葡萄糖，因此通過檢測培養(yǎng)基中的氨基葡萄糖含量，并根據(jù)公式來計(jì)算菌體量的方法是可行的。由圖6可以看出，在白地霉固態(tài)發(fā)酵過程中，前3d菌體生物量顯著增加，第3d菌體量達(dá)到最大，為0.2702g/g干物質(zhì)，稍后基本保持恒定變化較小，第6d開始下降，這可能是由于營養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗，營養(yǎng)不足，導(dǎo)致菌體大量死亡，此種方法較好地反映了白地霉固態(tài)發(fā)酵過程中菌體量的變化，為解決固態(tài)發(fā)酵菌體量檢測困難的問題提供了依據(jù)。

3　結(jié)論

本文對白地霉細(xì)胞組分中的特殊物質(zhì)——麥角固醇和氨基葡萄糖含量是否適合作為白地霉菌體量的檢測指標(biāo)進(jìn)行了一系列研究，最終得出了較為準(zhǔn)確的白地霉菌體量檢測方法。

3.1不同質(zhì)量的白地霉菌體中，麥角固醇和氨基葡萄糖含量與菌體量呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.99以上。

3.2通過檢驗(yàn)白地霉單位菌體內(nèi)麥角固醇和氨基葡萄糖含量的穩(wěn)定性，得到白地霉菌體量的檢測指標(biāo)。單位菌體內(nèi)氨基葡萄糖在白地霉生長過程中較為穩(wěn)定，不受培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基成分、搖床轉(zhuǎn)速的影響，適合作為白地霉菌體量的檢測指標(biāo)；而單位菌體內(nèi)麥角固醇受培養(yǎng)時間和培養(yǎng)基成分的影響較大，即不同菌齡和在不同培養(yǎng)基中生長的白地霉，其單位菌體內(nèi)麥角固醇含量波動較大，不適宜作為白地霉菌體量的檢測指標(biāo)。

3.3利用氨基葡萄糖法測得的白地霉菌體量與干重法測得的菌體量變化趨勢相同，兩種方法較為一致地顯示了白地霉在生長過程中菌體量的變化情況，因此菌體中氨基葡萄糖含量能夠較好地反映白地霉的生長狀況。

3.4將此方法應(yīng)用到白地霉固態(tài)發(fā)酵過程中，通過檢測固體培養(yǎng)基中的氨基葡萄糖含量間接得到微生物菌體量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在第3d菌體量達(dá)到最大，

為0.2702g/g干物質(zhì)，說明氨基葡萄糖法檢測白地霉固態(tài)發(fā)酵菌體量是可行的。

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Study on Geotrichum candidum biomass detection methods in fermentation process

ZHANG Liang-yu1，ZHAO Qiang-qiang1，HAO Ling-zhen1，LIU Zhu-bing2，GUAN Bin1，*，KONG Qing1，F(xiàn)AN Jin-shi2
（1．College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2．College of Chemical Engineering，Qingdao University of Science&Technology，Qingdao 266042，China）

The detection methods of Geotrichum candidum biomass in its fermentation process were discussed in this study.The feasibility of whether the cell components in Geotrichum candidum-ergosterol and glucosamine could be used as indicators for biomass estimation in fermentation was examined and analyzed.The experimental results showed that glucosamine could be a good biomass indicator as it remained constant in cells with the changes of culture time，culture condition and medium.Ergosterol amount changed with the different culture time and medium type；therefore，it could not accurately represent the changes of biomass.The growth curve of Geotrichum candidum measured by glucosamine method was in accordance with the growth curve by dry weight，so it could be able to reflect the changes of Geotrichum candidum biomass accurately.This method was also applied to the process of solid-state fermentation，getting the variation of Geotrichum candidum biomass in its process of solid-state fermentation quickly.So in solid-state fermentation，glucosamine could be used as the indicator to calculate Geotrichum candidum biomass indirectly，which provided the basis for biomass detection in solid-state fermentation.

Geotrichum candidum；biomass；ergosterol；glucosamine

TS201.3

A

1002-0306（2015）14-0184-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.030

2014－10－13

張良雨（1990-），女，碩士研究生，主要從事發(fā)酵工程方面的研究。

管斌（1957-），男，博士，教授，主要從事發(fā)酵工程方面的研究。

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃（2013BAD10B02-06）；青島市公共領(lǐng)域科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（11-2-3-63-nsh）；啤酒生物發(fā)酵工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（K2012002）。