早期斑禿皮損處炎癥細(xì)胞因子及凋亡因子的異常表達(dá)

蔡澤明 趙瑩 張斌 鞏毓剛 西蘭 楊建 章星琪

·研究報(bào)道·

早期斑禿皮損處炎癥細(xì)胞因子及凋亡因子的異常表達(dá)

蔡澤明 趙瑩 張斌 鞏毓剛 西蘭 楊建 章星琪

目的 探討早期斑禿皮損淺層、深層及斑禿生長(zhǎng)期毛囊凋亡因子及炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。方法收集25例早期斑禿皮損及15例正常頭皮病理取材組織標(biāo)本，通過熒光定量PCR檢測(cè)標(biāo)本中凋亡基因p53、caspase3、Fas和生存素、bcl-2 以及炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL）-4、IL-10、干擾素 γ（IFN-γ）、IL-12 mRNA 表達(dá)水平，免疫組化檢測(cè)皮損中生長(zhǎng)期毛囊P53的蛋白質(zhì)表達(dá)。結(jié)果 斑禿生長(zhǎng)期毛囊促凋亡因子caspase3、P53、Fas mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高，變化倍數(shù)分別為6.78、8.01、9.74，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。抑制凋亡因子bcl-2、生存素mRNA較正常降低，變化倍數(shù)分別為0.08、0.03（均P＜0.01），炎癥細(xì)胞因子無改變。斑禿淺層Th1因子IFN-γ、IL-12 mRNA較正常水平升高，變化倍數(shù)分別為2.75、85.67（P值分別＜0.05、0.01）。Th2因子IL-10表達(dá)水平降低，變化倍數(shù)為0.002（P＜0.01）。而且，斑禿皮損淺層IL-10及IL-12 mRNA改變幅度高于深層（P值分別＜0.01、0.05）。免疫組化顯示斑禿皮損生長(zhǎng)期毛囊每100個(gè)細(xì)胞中p53陽性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組升高（t=23.79，P＜0.01）。結(jié)論 斑禿生長(zhǎng)期毛囊凋亡因子升高，抑制凋亡因子表達(dá)下降提示凋亡因子在斑禿發(fā)病中起一定作用。

斑禿；細(xì)胞因子類；凋亡誘導(dǎo)因子；腫瘤抑制蛋白質(zhì)p53

斑禿發(fā)病過程中常伴有局部炎癥反應(yīng)，典型改變?yōu)樯L(zhǎng)期毛囊毛乳頭周圍蜂窩狀淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，該處炎癥細(xì)胞在斑禿發(fā)病中具體作用存在爭(zhēng)議。我們對(duì)斑禿皮損進(jìn)行病理檢查發(fā)現(xiàn)，早期斑禿存在頭皮淺層炎癥，前期研究還發(fā)現(xiàn)具有此類改變的斑禿預(yù)后較好，均提示淺層炎癥在斑禿發(fā)病中有一定作用［1-4］。探討斑禿發(fā)病時(shí)所存在的淺深層炎癥及Th1/Th2因子、細(xì)胞凋亡因子變化將有助于了解斑禿發(fā)病機(jī)制。我們檢測(cè)早期斑禿皮損邊緣頭皮淺層、深層及分離的生長(zhǎng)期毛囊炎癥細(xì)胞因子及凋亡因子mRNA表達(dá)水平，并分析各部位細(xì)胞因子變化差異，進(jìn)而探討Th1/Th2因子變化及凋亡因子在斑禿發(fā)病中的作用。

一、資料

1.2010年8月至2011年3月，收集本院脫發(fā)?？圃缙冢?］斑片型斑禿患者25例，其中男13例，女12例，年齡20～47歲，平均27.13歲，平均病程1.78個(gè)月。25例患者中1例有斑禿家族史，1例有特應(yīng)性皮炎病史。正常對(duì)照組男8例，女7例，年齡16～49歲，平均29.4歲，與斑禿組在性別及年齡上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有患者近1個(gè)月內(nèi)未系統(tǒng)或局部使用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑，15例對(duì)照來自本院外科頭皮手術(shù)如皮膚良性腫瘤或色素痣切除邊緣頭皮組織正常頭皮。本研究通過中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

2.試劑與儀器：RNA試劑盒產(chǎn)自美國(guó)Qiagen公司，S1000 thermal cyclerPCR儀產(chǎn)自美國(guó)伯樂BIO-RAD公司，Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒產(chǎn)自寶生物工程（大連）有限公司。

二、方法

1.取材：斑禿皮損邊緣約1 cm處行組織病理檢查，切取約10 mm×8 mm皮膚組織，分為兩份。一份用4%甲醛固定，石蠟包埋，切片后行免疫組化染色；另一份標(biāo)本在皮脂腺水平離斷，分為頭皮淺層、頭皮深層并置入RNA保存液中。部分標(biāo)本行毛囊分離，頭皮深層刀片沿毛囊生長(zhǎng)方向切成3 mm×6 mm小份，在解剖顯微鏡下眼科鑷夾住外毛根鞘將毛囊從皮下脂肪組織中拉出，將分離后的毛囊置入RNA保存液中，-20 ℃保存［3］。

2.p53免疫組化染色：常規(guī)制備。以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替p53單抗作陰性對(duì)照。在×400光鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)生長(zhǎng)期毛囊中部水平的視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野100個(gè)有核細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)。

3.熒光定量PCR檢測(cè)皮損炎癥細(xì)胞因子及凋亡因子mRNA表達(dá)水平：

（1）引物設(shè)計(jì)：參照基因序列軟件由寶生物工程（大連）有限公司合成引物如下：β肌動(dòng)蛋白，上游5′-CGACAACGG CTCCGGCATGTGC-3′，下游 5′-CGTCACCGGAGTCCATCAC GATGC-3′；白細(xì)胞介素（IL）-4，上游 5′-CTTCCCCCTCTGTT CTTCCT-3′，下游 5′-TTCCTGTCGAGCCGTTTCCAG-3′；IL-10，上游 5′-TGCTAACCGACTCCTTAATGCAGGAC-3′，下游 5′-CC TTGATTTCTGGGCCATGCTTCTC-3′；IL-12，上游 5′-TGGGTG GGTCAGGTTTGATG-3′，下游 5′-GCCCAGCTCTGAGGAGAG T-3′；caspase，上游 5′-GACTCTGGAATATCCCTGGACAAC-3′，下游 5′-CTGAGGTTTGCTGCA TCGACA-3′；bcl-2，上游 5′-A GGCACCCAGGGTGATGCAA-3′，下游 5′-GTGGAGGAGCTCTTC AGGGA-3′；p53，上游 5′-TCCA ATACAGCATGACTG-3′，下游5′-AGCCTCCAACATCCTTGAT TTCT-3′；Fas，上游 5′-TTGGT GGACCCGCTCAGTA-3′，下游5′-AATCTAGCAACAGACTAA GAACAAG-3′；生存素，上游5′-CCAAGTCTGGCTCGTTCTC AG-3′，下游 5′-CAGATTTGA ATCGCGGGACCC-3′。

（2）總RNA提?。焊鶕?jù)試劑盒說明書提取頭皮淺層、生長(zhǎng)期毛囊以及頭皮深層組織中總RNA，Thermo Nanodrop 2000測(cè)定RNA濃度，-80℃保存或立即合成為cDNA。

（3）cDNA的合成：使用S1000 thermal cyclerPCR儀合成cDNA，按照 Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒（DDR037A）20 μl反應(yīng)體系行總RNA逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系如下：緩沖液4 μl，隨機(jī)引物1 μl，反轉(zhuǎn)錄酶混合物 1 μl，寡 dT 引物 1 μl，總 RNA 300 ng加水至 20 μl。反應(yīng)條件如下：37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s cDNA-20℃保存。

（4）熒光定量PCR反應(yīng)：反應(yīng)體系20 μl如下：SYBR染料 Taq TM 酶 10 μl，Rox 校正液 0.4 μl，雙蒸水 7.8 μl，DNA模板1 μl（0.25 ng），上下游引物各0.4 μl（20 nmol/L）。反應(yīng)條件：預(yù)變性 95℃ 1 min，95℃ 5 s、63℃ 1 min 40個(gè)循環(huán)，95℃1 min、65℃30 s 1個(gè)循環(huán)?；虮磉_(dá)倍數(shù)改變（fold change）計(jì)算公式為2-ΔΔCt，ΔCt為樣本待測(cè)目的基因的Ct值與內(nèi)參照β肌動(dòng)蛋白Ct差值的均數(shù)，ΔΔCt為樣本目的基因ΔCt與正常對(duì)照ΔCt的差值，以2-ΔΔCt作為基因的相對(duì)表達(dá)水平。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。熒光定量PCR計(jì)量資料先用Shapiro-Wilk法檢驗(yàn)正態(tài)性，兩個(gè)均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多個(gè)均數(shù)及兩兩比較分別采用單因素方差分析（One-way ANOVA）及LSD-t檢驗(yàn)免疫組化結(jié)果采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、結(jié)果

1.斑禿皮損邊緣淺層、深層及生長(zhǎng)期毛囊炎癥細(xì)胞因子及凋亡因子mRNA表達(dá)：斑禿皮損邊緣分離的生長(zhǎng)期毛囊促凋亡基因如caspase3、p53、Fas mRNA表達(dá)水平均較正常對(duì)照組升高（t=2.41、2.27、2.73，均P＜ 0.05），抑制凋亡因子如bcl-2、生存素mRNA表達(dá)水平顯著降低（t=6.76 6.87，均P＜0.01）。斑禿皮損中生長(zhǎng)期毛囊炎癥細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12、IL-10及IL-4mRNA表達(dá)水平與正常毛囊差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1，2。

斑禿皮損邊緣淺層IFN-γ、IL-12較正常對(duì)照頭皮淺層升高（t值分別為 2.59、10.51，P值分別 ＜ 0.05，0.01），IL-10降低（t=9.42，P＜ 0.01）。凋亡因子如 caspase3、p53、Fas mRNA表達(dá)水平在斑禿皮損淺層和正常頭皮之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。斑禿皮損邊緣深層IL-12 mRNA表達(dá)水平較正常對(duì)照頭皮深層顯著升高（t=3.28，P ＜ 0.05），IL-4、IFN-γ、IL-10表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。斑禿皮損深層各凋亡因子表達(dá)水平與正常對(duì)照之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1，2。

表1 斑禿皮損邊緣及淺層、深層生長(zhǎng)期毛囊各炎癥細(xì)胞因子表達(dá)水平（2-ΔΔCt）

表2 斑禿生長(zhǎng)期毛囊、淺層、深層凋亡因子表達(dá)水平（2-ΔΔCt）

斑禿皮損淺層IL-12、IL-10變化幅度高于皮損深層，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.36、35.16，P 值分別 ＜ 0.05、0.01）。斑禿淺深層 IFN-γ、IL-4、p53、Fas凋亡受體、bcl-2、生存素等因子變化幅度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.生長(zhǎng)期毛囊p53表達(dá)情況：免疫組化染色中p53為核內(nèi)著色，在正常對(duì)照的表皮基底層、毛囊內(nèi)外毛根鞘、皮脂腺、小汗腺以及皮下脂肪細(xì)胞均可見p53染色陽性的細(xì)胞，其中以毛囊周期性部分的外毛根鞘細(xì)胞p53表達(dá)程度較強(qiáng)，陽性率較高（圖1A）。早期斑禿皮損邊緣的生長(zhǎng)期毛囊p53陽性細(xì)胞數(shù)目和陽性率顯著高于正常對(duì)照，正常對(duì)照生長(zhǎng)期毛囊細(xì)胞中p53陽性細(xì)胞數(shù)為47.65±5.27，斑禿生長(zhǎng)期毛囊細(xì)胞 p53陽性細(xì)胞數(shù)為 89.58±5.32（t=23.79，P ＜0.01），見圖1。

四、討論

目前研究多認(rèn)為斑禿發(fā)病是在具有遺傳易感性基礎(chǔ)上，在環(huán)境、神經(jīng)內(nèi)分泌、免疫等多因素影響下的，由T細(xì)胞介導(dǎo)以Th1型反應(yīng)為特征、針對(duì)生長(zhǎng)期毛囊的器官特異性自身免疫性疾?。?］。免疫豁免喪失是斑禿發(fā)病的重要機(jī)制之一，正常生長(zhǎng)期毛囊局部主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ類分子（MHC-Ⅰ、Ⅱ）、細(xì)胞間黏附因子1（ICAM-1）低表達(dá)而處于免疫豁免，斑禿發(fā)病時(shí)上述因子表達(dá)升高致免疫豁免喪失，毛囊抗原被自身T淋巴細(xì)胞識(shí)別而發(fā)生免疫應(yīng)答［5-7］。

研究中，我們發(fā)現(xiàn)早期斑禿皮損邊緣生長(zhǎng)期毛囊僅出現(xiàn)凋亡因子水平上升而趨向凋亡，毛囊自身并不出現(xiàn)可改變周期的炎癥細(xì)胞因子變化，提示斑禿毛囊的凋亡更可能源于皮損中細(xì)胞因子的變化，而不是自身周期的體現(xiàn)。斑禿皮損淺層Th1類細(xì)胞因子如IL-12、IFN-γmRNA表達(dá)水平顯著升高，Th2類細(xì)胞因子IL-10表達(dá)水平顯著降低，該結(jié)果與既往研究一致，即Th1占優(yōu)勢(shì)的Th1/Th2是斑禿重要發(fā)病機(jī)制。我們還發(fā)現(xiàn)斑禿皮損淺層的Th1類細(xì)胞因子IFN-γ升高幅度、Th2類因子IL-10降低幅度均大于深層，細(xì)胞因子在皮膚內(nèi)分布一般由高濃度區(qū)向低濃度區(qū)彌散，提示引起斑禿的Th1/Th2因子失衡的源頭可能存在于淺層，即淺層的炎癥重要性可能大于深層，深層毛乳頭附近的炎癥可能為繼發(fā)性或反應(yīng)性的。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)早期斑禿頭皮淺層血管周圍有炎癥浸潤(rùn)以及淺層毛囊外毛根鞘的外層細(xì)胞液化變性［1］。另有報(bào)道斑禿皮損毛乳頭附近出現(xiàn)含有異物巨細(xì)胞的肉芽腫，支持該處的炎癥可能是針對(duì)毛囊細(xì)胞死亡釋放產(chǎn)物的Th1型肉芽腫反應(yīng)［8］。我們?cè)诩毙赃M(jìn)展期彌漫性斑禿患者中發(fā)現(xiàn)毛乳頭附近出現(xiàn)異物巨細(xì)胞，估計(jì)可能是局部區(qū)域內(nèi)全體毛囊細(xì)胞快速凋亡并釋放大量細(xì)胞產(chǎn)物所致［9-10］。上述過程臨床上表現(xiàn)為斑禿生長(zhǎng)期毛囊急速?gòu)V泛退行性變，導(dǎo)致皮損深層毛乳頭附近出現(xiàn)繼發(fā)性炎癥，以清除大量出現(xiàn)的退行凋亡毛囊細(xì)胞及其分解產(chǎn)物。至于斑禿的發(fā)病，我們?cè)l(fā)現(xiàn)斑禿患者的表皮聚絲蛋白表達(dá)水平下降，以及斑禿小鼠的垂體-腎上腺系統(tǒng)反應(yīng)異常，均可作為斑禿的誘發(fā)因素［11-12］。

圖1 免疫組化檢測(cè)生長(zhǎng)期毛囊p53表達(dá)（DAB×100） 1A：正常對(duì)照頭皮；1B：斑禿皮損

我們推測(cè)斑禿可能的發(fā)病機(jī)制如下：在一定遺傳因素下，各種原因如皮膚屏障缺陷或神經(jīng)因素所致的淺層炎癥觸發(fā)Th1類因子升高和（或）Th2類因子降低，淺層毛囊屬于永久毛囊，含有干細(xì)胞以及可能對(duì)毛囊周期的變化起決定性作用的成分，引起局部區(qū)域內(nèi)毛囊發(fā)生退行性變。淺層的細(xì)胞因子通過彌散作用逐漸致深層Th1類因子升高、Th2類因子降低，從而誘導(dǎo)深層附近毛囊MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子和ICAM-1表達(dá)升高，導(dǎo)致毛囊免疫赦免喪失，局部自身抗原暴露，被抗原提呈細(xì)胞提呈，加之細(xì)胞凋亡后釋放的細(xì)胞產(chǎn)物，引起毛囊周圍繼發(fā)性CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及活化，后者進(jìn)一步分泌釋放各種細(xì)胞因子，趨化單核巨噬細(xì)胞，吞噬死亡細(xì)胞產(chǎn)物，引起免疫反應(yīng)級(jí)聯(lián)擴(kuò)大，導(dǎo)致斑禿皮損進(jìn)一步擴(kuò)大。

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Abnormal expressions of inflammatory cytokines and apoptosis-related factors in lesions of early alopecia areata

Cai Zeming*,Zhao Ying,Zhang Bin,Gong Yugang,Xi Lan,Yang Jian,Zhang Xingqi.*Department of Dermatology,Third Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 332000,China

ObjectiveTo detect the expressions of apoptosis-related factors and inflammatory cytokines in superficial and deep layers of as well as anagen hair follicles in lesions of early alopecia areata （AA）.MethodsScalp biopsy samples were collected from 25 patients with early AA and 15 healthy human controls.Fluorescence-based quantitative PCR was performed to detect mRNA expressions of apoptosis-related genes p53,caspase 3,Fas,survivin and bcl-2,as well as those of inflammatory cytokines interleukin （IL）-4,IL-10,IL-12 and interferon （IFN）-γ.An immunohistochemical assay was conducted to measure the expression of p53 protein in anagen hair follicles.ResultsCompared with control skin samples,anagen hair follicles in AA lesions showed significantly increased mRNA expression levels（expressed as 2-ΔΔCt）of pro-apoptotic factors caspase 3,p53 and Fas（6.78,8.01,9.74,respectively,all P ＜ 0.05）,but decreased mRNA expression levels of antiapoptotic factors bcl-2 and survivin （0.08 and 0.03 respectively,bothP ＜ 0.01）,and similar mRNA expression levels of inflammatory cytokines.There was a significant increase in mRNA expression levels of Th1 cytokines IFN-γ and IL-12（2.75 vs.1.00,P＜0.05;85.67 vs.1.00,P＜0.01）,but a significant decrease in the expression level of the Th2 cytokine IL-10 （0.002 vs.1.000,P ＜ 0.01）in superficial layers of AA lesions compared with those of normal control skin.The degree of changes in mRNA expression levels of IL-10 and IL-12 was significantly higher in superficial layers than in deep layers of AA lesions （P＜0.01 and 0.05 respectively）.The immunohistochemical assay showed that the number of p53-positive cells per 100 cells in anagen hair follicles of AA lesions was higher than that in those of control skin （t=23.79,P＜0.01）.Conclusions Anagen hair follicles in AA lesions exhibit high expressions of pro-apoptosis factors,but low expressions of antiapoptotic factors,suggesting that apoptotic factors play a role in the occurrence of AA.

Alopecia areata;Cytokines;Apoptosis-inducing factor;Tumor suppressor protein p53

Zhang Xingqi,Email:xingqi.zhang@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.02.017

332000南昌大學(xué)第三附屬醫(yī)院皮膚科（蔡澤明）；山東菏澤市立醫(yī)院皮膚科（趙瑩）；中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科（張斌、鞏毓剛、西蘭、楊建、章星琪）

章星琪，Email：xingqi.zhang@aliyun.com

2014-03-09）

（本文編輯：尚淑賢）