藥疹患者外周血單一核細(xì)胞中巨細(xì)胞病毒的檢測

李雙庚 陳官芝 肖君剛 王君 潘敏

藥疹患者外周血單一核細(xì)胞中巨細(xì)胞病毒的檢測

李雙庚 陳官芝 肖君剛 王君 潘敏

目的 探討人巨細(xì)胞病毒（CMV）感染在藥疹發(fā)病中的作用。方法 收集44例藥疹患者（其中重型藥疹13例）及50例健康對照外周血，Taqman實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測外周血單一核細(xì)胞中CMV DNA陽性率及載量；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清CMV IgM陽性率。結(jié)果 44例藥疹患者CMV DNA陽性率（65.91%，29/44例）高于健康對照組（28.00%，14/50例），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.552，P<0.05）；重型藥疹患者（11/13例）、輕型藥疹患者（58.06%，18/31例）及健康對照組CMV DNA陽性率不完全相等（χ2=16.153，P<0.05），其中重型組高于輕型組（χ2=13.817，P<0.05）及對照組（χ2=7.237，P<0.05）；藥疹患者CMV DNA載量（28 183.829±19 527.654）拷貝高于健康對照組（3 019.952±1 760.952）拷貝，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t′=8.517，P<0.05），重型藥疹患者（554 813.389 ± 722 642.498）拷貝、輕型藥疹患者（13 290.558±14 082.356）拷貝與對照組間CMV DNA載量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。藥疹患者CMV IgM陽性率（13.64%，6/44例）與健康對照組（6.00%，3/50例）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；輕型藥疹（6.45%，2/31例）、重型藥疹（4/13例）及健康對照組各組均數(shù)不完全相等（χ2=7.832，P<0.05），其中重型組高于對照組（χ2=6.409，P<0.05）。結(jié)論 藥疹患者存在CMV感染，CMV感染可能是藥疹發(fā)病或加重的因素之一。

藥疹；巨細(xì)胞病毒；巨細(xì)胞病毒感染

2.主要試劑：全血DNA提取試劑盒購于北京百泰克生物技術(shù)有限公司，pMD18-T載體、E.coliCompetent Cell JM109、Hind III限制酶、EASY Dilution購于寶生物工程（大連）有限公司，HotMaster PCR MasterMix購于北京天根生化科技有限公司，Taqman熒光定量PCR試劑盒購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，CMV IgM ELISA試劑盒購于德國IBL公司。

3.引物及探針序列：參照文獻［8］設(shè)計CMV特異性引物和探針，由寶生物工程（大連）有限公司合成，CMV上游引物序列：5′-AACTCAGCCTTCCCTAAGACCA-3′，探針序列：5′-FAM-CAATGGCTGCAGTCAGGCCATGG-TAMRA-3′，下游引物序列：5′-GGGAGCACTGAGGCAAGTTC-3′，擴增產(chǎn)物 76 bp。

4.標(biāo)本制備：采集藥疹患者急性期（發(fā)疹2～7 d）與健康對照晨起空腹靜脈血3 ml EDTA抗凝，提取外周血單一核細(xì)胞DNA，操作方法按試劑盒說明書進行，-20℃保存?zhèn)溆?。同時采集藥疹患者與健康對照晨起空腹靜脈血3 ml，分離血清，-80℃保存用于ELISA。實驗所需的DNA陽性對照來自CMV B189病毒株，由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院張文卿教授惠贈。

5.方法：實時熒光定量PCR測定外周血單一核細(xì)胞CMV DNA陽性率及載量：反應(yīng)體系為25 μl，含2×HotMaster PCR混合物 12.5 μl，上下游引物（20 μmol/L）各 1 μl，模板（CMV B189 病毒株 DNA）2 μl，ddH2O 8.5 μl。反應(yīng)條件為 95 ℃預(yù)變性30 s；然后 95℃ 5 s，57℃ 30 s，共40個循環(huán)；最后 72℃延伸5 min。每份標(biāo)本均做3次重復(fù)實驗取均值。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠進行電泳（100 V，40 min），凝膠電泳掃描系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果，證實為CMV及其特異性片段。

重組質(zhì)?？寺〖百|(zhì)粒線性化：PCR擴增產(chǎn)物連接pMD-18-T載體后轉(zhuǎn)化入E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，37℃培養(yǎng)過夜（用X-gal/IPTG/Amp＋LB平板）得到大量轉(zhuǎn)化子；提取質(zhì)粒DNA模板，用HindⅢ限制酶進行線性化處理，PCR抽提、乙醇精制后得到標(biāo)準(zhǔn)品DNA。觀察標(biāo)準(zhǔn)品DNA電泳結(jié)果及測定A值。產(chǎn)物測序所得序列與基因庫比對，結(jié)果表明擴增片段重組后無變異發(fā)生。

實時熒光定量PCR檢測臨床標(biāo)本：將構(gòu)建的CMV標(biāo)準(zhǔn)品 DNA（107拷貝/μl）用 EASY Dilution 按 10 倍梯度稀釋（0、101、102、103、104、105倍）作為模板，進行實時 PCR 反應(yīng)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對臨床標(biāo)本進行檢測。反應(yīng)體系為20 μl，含2 × GoldStar TaqMan Mixture 10 μl，上下游引物（20 μmol/L）各 0.4 μl，探針 0.8 μl，模板 2 μl，RNase 淡水 6.4 μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s；然后95℃ 5 s，57℃ 30 s，共40個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。每份標(biāo)本均做3次生物學(xué)重復(fù)實驗，每次實驗設(shè)陽性對照及陰性對照，陰性對照用RNase-淡水替換模板DNA。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠進行電泳，得到預(yù)期擴增片段。

PCR復(fù)制效率、檢測的準(zhǔn)確性及重復(fù)性：構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)品DNA可以得到較好的擴增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線。CMV標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)0.993，擴增效率0.908，可以在較寬的范圍內(nèi)進行準(zhǔn)確定量，且3個平行樣品重復(fù)性好。

ELISA法檢測血清CMV IgM陽性率：參照試劑盒說明書進行，每份標(biāo)本均做3個復(fù)孔。

6.統(tǒng)計學(xué)方法：SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計處理，定量檢測結(jié)果以±s表示，2組間均數(shù)比較采用t′檢驗，3組間均數(shù)比較采用秩和檢驗；定性數(shù)據(jù)用率表示，組間率的比較采用χ2檢驗。

二、結(jié)果

1.CMV DNA陽性率檢測：44例藥疹患者CMV DNA陽性率為 65.91%（29/44），健康對照組為 28.00%（14/50），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.552，P<0.05）。重型患者（11/13例）、輕型患者（58.06%，18/31例）、健康對照組CMV DNA陽性率依次遞減，各組總體率不等或不完全相等（χ2=16.153，P<0.05），其中重型組高于輕型組（χ2=13.817，P<0.0167）及對照組（χ2=7.237，P<0.0167），見表 1。

2.CMV DNA載量檢測：44例藥疹患者CMV DNA載量拷貝高于健康對照組拷貝，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t′=8.517，P<0.05）；重型藥疹患者拷貝、輕型藥疹患者拷貝、健康對照組CMV DNA載量依次遞減，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表 1。

3.藥疹患者組與健康對照組CMV特異性IgM檢測：藥疹患者CMV IgM陽性率（13.64%，6/44例）與健康對照組（6.00%，3/50例）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；輕型藥疹（6.45%，2/31例）、重型藥疹（4/13例）及健康對照組各組均數(shù)不完全相等（χ2=7.832，P<0.05），其中重型組高于對照組（χ2=6.409，P<0.0167），見表 1。

表1 藥疹患者與健康對照CMV DNA及CMV IgM檢測（例）

三、討論

CMV又名人皰疹病毒5型（HHV-5），可引起感染細(xì)胞形成巨細(xì)胞，能在唾液腺、腎和單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)中建立潛伏感染，與HHV-6及HHV-7同屬β皰疹病毒亞科，基因組具有同源性，抗原性亦有部分交叉，宿主范圍窄，生長周期長［9］。有報道，藥疹的發(fā)生與病毒感染有關(guān)，特別是人皰疹病毒和人免疫缺陷病毒［1］。LeClaire 等［10］報道的傳染性單核細(xì)胞增多癥患者使用氨芐西林等抗生素治療，常導(dǎo)致全身性麻疹樣皮疹，當(dāng)傳染性單核細(xì)胞增多癥急性期消退后再用這些藥物治療，患者麻疹樣皮疹不復(fù)發(fā)。Kano等［5］研究發(fā)現(xiàn)，藥物超敏反應(yīng)綜合征患者癥狀于停用病因藥物之后仍持續(xù)發(fā)展并轉(zhuǎn)為遷延化，原因除了特定的藥物及遺傳因素之外，此類患者體內(nèi)存在潛伏感染病毒的再激活，主要是人皰疹病毒。

本文結(jié)果顯示，藥疹患者組CMV DNA陽性率及病毒載量高于健康對照組；與健康對照比較，CMV DNA陽性率有隨藥疹病情加重升高趨勢，提示CMV感染可能與藥疹有關(guān)，CMV可能為導(dǎo)致藥疹發(fā)病或加重的一個危險因素。但CMV DNA載量無論在重型藥疹患者、輕型藥疹患者及健康對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，推測CMV感染參與藥疹的發(fā)生發(fā)展可能并不需要較高的病毒量維持。

特異性IgG和IgM檢測是區(qū)分CMV潛伏感染和活動性感染最為常用的指標(biāo)。藥疹患者血清中病毒特異性抗體的測定作為研究病毒與藥疹關(guān)系的有效手段已被國外學(xué)者廣泛應(yīng)用，CMV特異性IgM抗體的出現(xiàn)提示活動性CMV感染。本文結(jié)果顯示，重型藥疹患者組IgM陽性率明顯高于健康對照組，提示藥疹患者特別是重型藥疹患者可能存在活動性CMV感染。

總之，CMV原發(fā)感染后可在體內(nèi)長期潛伏，一定條件下可被激活，導(dǎo)致機體免疫系統(tǒng)功能紊亂，可能成為藥疹的促發(fā)因素加快疾病的發(fā)展進程。本文結(jié)果提示：藥疹患者中存在CMV的活動性感染和DNA陽性率及病毒載量增加，CMV感染可能是影響藥疹發(fā)病及加重的環(huán)境因素之一。

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Detection of cytomegalovirus in peripheral blood mononuclear cells of patients with drug eruptions

Li Shuanggeng,Chen Guanzhi*,Xiao Jungang,Wang Jun,Pan Min.*Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266003,China

Chen Guanzhi,Email:chenguanzhi@outlook.com

Objective To investigate the role of human cytomegalovirus （CMV）in the occurrence of drug eruptions.Methods Peripheral blood samples were collected from 44 patients with drug eruptions（including 13 severe cases） and 50 healthy human controls.Taqman fluorescent real-time quantitative PCR （RT-PCR） was performed to determine the positive rate and load of CMV DNA in peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was conducted to detect anti-CMV IgM antibodies in sera.Results The positive rate of CMV DNA was significantly higher in the patients than in the controls（65.91% （29/44）vs.28.00%（14/50）,χ2=13.552,P<0.05）,significantly different among patients with severe drug eruptions（11/13）,patients with mild drug eruptions（58.06%（18/31））and the controls（χ2=16.153,P<0.05）.In addition,patients with severe drug eruptions showed a higher positive rate of CMV DNA compared with patients with mild drug eruptions（χ2=13.817,P<0.05）and the controls（χ2=7.237,P<0.05）.CMV DNA load was significantly higher in the patients than in the controls（（28 183.829 ± 19 527.654）vs.（3 019.952 ± 1 760.952）copies,t′=8.517,P<0.05）.No significant difference was found in CMV DNA load between patients with severe drug eruptions（（554 813.389 ± 722 642.498）copies）,patients with mild drug eruptions （（13 290.558 ± 14 082.356）copies））and the controls（P>0.05）.The positive rate of anti-CMV IgM antibodies was similar between the patients and controls（13.64%（6/44）vs.6.00%（3/50）,P>0.05）,but significantly different among patients with severe drug eruptions（4/13）,patients with mild drug eruptions（6.45%,2/31）and the controls（χ2=7.832,P<0.05）,and significantly higher in patients with severe drug eruptions than in the controls （χ2=6.409,P<0.05）.Conclusions CMV infection exists in patients with drug eruptions,and might be a factor associated with the initiation and aggravation of drug eruptions.

Drug eruptions;Cytomegalovirus;Cytomegalovirus infections

我們前期研究［1-3］結(jié)果表明，EB病毒和人類皰疹病毒6型及7型（HHV-6，HHV-7）感染與藥疹的發(fā)生相關(guān)。近年來藥疹的病毒感染因素受到重視，活動性病毒感染可改變機體的免疫調(diào)節(jié)功能，增加免疫系統(tǒng)的敏感性［4］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在藥物超敏反應(yīng)綜合征患者中，可以觀察到人類皰疹病毒的激活增殖［5］。這些病毒在體內(nèi)可互相關(guān)聯(lián)，一種病毒的激活復(fù)制可導(dǎo)致其他病毒的激活復(fù)制［6］。我們用Taqman實時熒光定量PCR檢測外周血單一核細(xì)胞中巨細(xì)胞病毒（CMV）DNA陽性率及載量，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測定血清CMV IgM陽性率，探討CMV感染在藥疹發(fā)生中的作用。

一、對象與方法

1.臨床資料：2011年9月至2013年7月青島大學(xué)附屬醫(yī)院、青島市膠州中心醫(yī)院皮膚科門診和住院藥疹患者44例，其中女20例，男24例，年齡17～63歲，平均（40.79±17.72）歲。所有患者均有明確的服藥史，在服藥后2 h至7 d（平均4.03 d）出現(xiàn)皮疹，符合藥疹的診斷和分型標(biāo)準(zhǔn)［7］。其中重型藥疹13例，包括超敏反應(yīng)綜合征1例、Steven-Johnson綜合征2例、大皰性表皮松解型4例、剝脫性皮炎型6例。輕型藥疹31例，包括固定型、麻疹型或猩紅熱型、蕁麻疹型、多形紅斑型等臨床常見類型。致敏藥物有：青霉素或頭孢類17例，占38.64%；磺胺類3例，占6.82%；解熱鎮(zhèn)痛藥11例，占25.00%；抗癲癇藥5例，占11.36%；別嘌醇1例，占2.27%；中藥或中成藥7例，占15.91%。選擇同期體檢者50例作為健康對照組，其中男、女各25例，年齡18～68歲，平均（41.96±15.17）歲，兩組性別和年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）。本研究通過青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.01.020

青島市公共領(lǐng)域科技支撐計劃項目（09-1-1-24-nsh）

266003青島大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科［李雙庚（現(xiàn)在青島市膠州中心醫(yī)院皮膚科，266300）、陳官芝、肖君剛、王君、潘敏］

陳官芝，Email：chenguanzhi@outlook.com

2014-05-20）

（本文編輯：吳曉初）