低毒高效提取雨生紅球藻中蝦青素的工藝優(yōu)化

徐　健，倪曉鋒，沈生榮（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058）

低毒高效提取雨生紅球藻中蝦青素的工藝優(yōu)化

徐健，倪曉鋒，沈生榮*
（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058）

隨著蝦青素的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，提取劑的安全性問題也日益突出。以雨生紅球藻為原料，研究了多種提取劑的得率，以選出低毒高效的提取溶劑。同時(shí)，還研究了料液比、溫度及提取時(shí)間對(duì)雨生紅球藻中活性成分蝦青素得率的影響，并通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取參數(shù)，獲得最佳提取工藝。結(jié)果顯示，各因素對(duì)得率的影響大小依次為：料液比＞提取時(shí)間＞溫度＞提取溶劑。提取溶劑、料液比、溫度和提取時(shí)間的最佳條件分別是：乙酸乙酯∶乙醇（1∶1）、1∶100、40℃、20 min，最佳得率為49.96%。

雨生紅球藻，蝦青素，低毒高效，提取

蝦青素（Astaxanthin），3，3’-二羥基-4，4’-二酮基-β，β’-胡蘿卜素，又稱蝦黃質(zhì)，蝦黃素，分子式為C40H52O4。它是一種存在于蝦蟹外殼、牡蠣、鮭魚及藻類、真菌中的紅色類胡蘿卜素，具有較強(qiáng)的抗氧化和抗炎癥作用等，被稱為“超級(jí)維生素E”［1-2］，在水產(chǎn)養(yǎng)殖、食品、化工、醫(yī)藥等方面有著良好的應(yīng)用前景。雨生紅球藻是一種淡水綠藻，屬于綠藻綱團(tuán)藻目紅球藻科。在不利的條件下，雨生紅球藻中蝦青素的含量可高達(dá)干重的6%，并且自身具有普通微藻所需營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，因此被認(rèn)為是生產(chǎn)蝦青素最好的自然資源［3］。

蝦青素是一類酮式類胡蘿卜素，不溶于水，能溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑［4］。從藻類中制備蝦青素一直都是天然蝦青素生產(chǎn)工藝的研究熱點(diǎn)，已報(bào)道的有溶劑浸提法、酶法、微波輔助萃取、超臨界CO2萃取、連續(xù)相變萃取技術(shù)等方法。這些制備方法各有利弊，較為常見的是溶劑浸提法，該方法工藝簡(jiǎn)單，容易操作，無需昂貴的專業(yè)設(shè)備。但目前的溶液浸提法仍然存在一些可待優(yōu)化的方面，如甲醇等有機(jī)溶劑有一定的毒性，可能會(huì)給生產(chǎn)和使用帶來危害。此外，過高的提取溫度和較長(zhǎng)的提取時(shí)間也容易影響蝦青素的活性。因此選擇低毒的提取溶劑，研究其是否能夠在更短的時(shí)間和更低的溫度下獲得較高的蝦青素得率，有利于進(jìn)一步優(yōu)化溶劑浸提法，從而節(jié)省資源，獲得更大的效益。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）藻粉1.1%，寧波紅龍生物科技有限公司；98%蝦青素標(biāo)品Aladdin公司；99%二甲基亞砜（DMSO）、95%乙醇、96%氫氧化鈉國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、丙酮、乙酸乙酯99.5%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Agilent1200高效液相色譜儀安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；Kinetex XB-C18色譜柱（100 mm×4.60 mm，2.6 μm） 廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蝦青素的提取工藝溶劑法萃取分離蝦青素主要工藝是先將雨生紅球藻粉碎，用混合有機(jī)溶劑萃取，實(shí)現(xiàn)蝦青素的提?。?］。本實(shí)驗(yàn)采用的是破壁之后的雨生紅球藻粉，在避光條件下直接加入有機(jī)溶劑恒溫提取10 min。然后將固液混合物以4000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至容量瓶中，同時(shí)用提取劑洗滌殘?jiān)?，上述條件下再離心取上清液，重復(fù)洗滌直至殘?jiān)驶野咨?。收集上清液，定容，即得蝦青素初提液。向初提液中加入少量皂化液（NaOH-甲醇），低溫皂化后，用HPLC測(cè)定蝦青素的含量。

圖1　蝦青素的提取工藝Fig.1　Extraction of astaxanthin

1.2.2蝦青素含量的測(cè)定

1.2.2.1色譜分析條件［6］色譜柱：色譜柱為Kinetex XB-C18柱（100 mm×4.60 mm，2.6 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（95∶5）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：482 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL；樣品采取低溫避光皂化12 h后HPLC測(cè)定。

1.2.2.2蝦青素標(biāo)曲的制作精密稱取3 mg蝦青素標(biāo)品，置100 mL容量瓶中，用少量二氯甲烷（約10 mL）振蕩使溶解，用甲醇稀釋至刻度，作為蝦青素儲(chǔ)備液。分別精密移取5、10、15、20、25 mL儲(chǔ)備液至預(yù)先各加有4 mL二氯甲烷的5個(gè)100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即配制成了1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 μg/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算蝦青素含量。色譜圖見圖2。

1.2.2.3蝦青素的得率

式中：Y為雨生紅球藻中蝦青素的得率；C為蝦青素的濃度，μg/mL；V為提取液的總定容體積，mL；M為所用的雨生紅球藻的干重，g。

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1提取溶劑稱取12份冷凍干燥并破碎后的藻粉約100 mg，按著表1中的順序，分別加入10 mL的提取溶劑，振蕩15 s，于45℃中提取60 min。水浴后以4000 r/min離心5 min；吸取上清液，移入25 mL棕色容量瓶中。用提取劑洗殘?jiān)?，重?fù)該步驟直至藻渣呈灰白色，合并上清液并定容，得到蝦青素提取液。

表1　蝦青素提取劑編號(hào)表Table 1　List of different solvents

從容量瓶中取出5 mL提取液，4000 r/min離心5 min，從中取出2.5 mL于10 mL棕色容量瓶中，加入2.5 mL皂化液（0.02 mol/L NaOH-甲醇），4℃避光皂化12 h，皂化后用甲醇定容至10 mL。將皂化后的蝦青素提取液過0.45 μm膜，然后用HPLC測(cè)定蝦青素的含量。每種溶劑重復(fù)3次，每個(gè)樣品進(jìn)樣3次，取平均值，計(jì)算蝦青素得率。

1.2.3.2料液比稱取5份冷凍干燥并破碎后的藻粉約100 mg，分別加入5、10、15、20、25 mL的乙酸乙酯∶乙醇（1∶3），同1.2.3.1操作，每種液料比重復(fù)3次，每個(gè)樣品進(jìn)樣3次，取平均值，計(jì)算蝦青素得率。

1.2.3.3溫度稱取5份冷凍干燥并破碎后的藻粉約100 mg，加入10 mL的乙酸乙酯∶乙醇（1∶3），振蕩15 s，分別于35、40、45、50、55℃中提取60 min。水浴提取后，同1.2.3.1操作，每種溫度重復(fù)3次，每個(gè)樣品進(jìn)樣3次，取平均值，計(jì)算蝦青素得率。

1.2.3.4提取時(shí)間稱取5份冷凍干燥并破碎后的藻粉約100 mg，加入10 mL的乙酸乙酯∶乙醇（1∶3），振蕩15 s，分別于45℃提取10、20、30、40、50 min。水浴提取后，同1.2.3.1操作，每種提取時(shí)間重復(fù)3次，每個(gè)樣品進(jìn)樣3次，取平均值，計(jì)算蝦青素得率。

1.2.4蝦青素提取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取提取溶劑、料液比、溫度、提取時(shí)間這四個(gè)因素作為實(shí)驗(yàn)因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，以蝦青素得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，探討從雨生紅球藻中提取蝦青素的最佳工藝參數(shù)，實(shí)驗(yàn)因素水平如表2所示。

表2　蝦青素提取正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2　Orthogonal design of astaxanthin extraction

1.2.5數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Origin 8.0和SAS 8.0進(jìn)行，繪圖采用Microsoft Excel 2003進(jìn)行，數(shù)值表示為平均值±SD。

2　結(jié)果與分析

2.1蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2　蝦青素標(biāo)品的色譜圖Fig.2　Chromatogram of astaxanthin

圖3　蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3　Standard curve of astaxanthin

圖2、圖3分別為蝦青素標(biāo)品色譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)曲方程為：Y=76.70667X-0.6667，R2=0.99934式中：Y為峰面積；X為蝦青素濃度μg/mL；R2為相關(guān)系數(shù)。

2.2單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1提取溶劑對(duì)蝦青素得率的影響蝦青素具有脂溶性，不溶于水，溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑［7］，因此分別選擇DMSO、乙酸乙酯、丙酮、乙醇等常用有機(jī)溶劑及其混合溶液作為萃取溶劑。如圖4所示，不同的提取溶劑，藻粉中蝦青素的提取得率有一定的差異。DMSO的得率最低，為27.41%，乙酸乙酯∶乙醇（1∶3）的提取得率最高，為53.84%，其次為乙酸乙酯∶乙醇（1∶2）為47.92%。綜合來看，復(fù)合溶劑的提取效率高于單一溶劑。DMSO是重要的極性溶劑，提取過程中向細(xì)胞中滲透的速度較快，疏水性差，因而作為單一溶劑時(shí)，蝦青素的溶出率較低?？紤]到產(chǎn)品中溶劑殘留的安全性問題，盡量選用無毒無害溶劑［8］。同時(shí)，選擇疏水性較強(qiáng)的溶劑有利于提高蝦青素的溶出率。DMSO極易滲透皮膚，但本身的毒性較低；乙酸乙酯有著良好的疏水性，是工業(yè)上廣泛使用的低毒溶劑，GB29224-2012允許其作為食品添加劑使用；乙醇作為混合溶劑的一部分，可以增加提取劑的極性，有助于提高提取效率。因此，選擇乙酸乙酯∶乙醇（1∶3）是低毒高效提取藻粉中蝦青素的最佳提取劑。

圖4　不同提取溶劑的蝦青素得率Fig.4　Extraction yield of astaxanthin with different solvents

圖5　不同料液比的蝦青素得率Fig.5　Extraction yield of astaxanthin with different solid-liquid ratio

2.2.2料液比對(duì)蝦青素得率的影響由圖5可知，蝦青素的得率隨料液比增加，呈上升趨勢(shì)。在料液比為1∶200時(shí)，蝦青素的得率最高，為49.69%。可以看出，料液比在1∶200之前，隨著藻粉用量的增加，蝦青素得率變化幅度較大，而1∶200～1∶250之間變化幅度不大。這主要是因?yàn)樵谔崛┯昧枯^少時(shí)，蝦青素和藻粉的接觸面積有限，隨著提取劑用量增加，蝦青素得率也隨之增加。當(dāng)提取劑增加到一定程度時(shí)，藻粉與提取劑已達(dá)到充分接觸的狀態(tài)，此時(shí)再增加提取劑，蝦青素的得率變化不大。出于成本考慮，確定料液比為1∶200。

圖6　不同溫度的蝦青素得率Fig.6　Extraction yield of astaxanthin with different temperature

2.2.3溫度對(duì)蝦青素得率的影響從圖6可以看出，隨著溫度的改變，藻粉中蝦青素的得率有所變化，組間差異較為明顯。40℃條件下蝦青素的得率最高，當(dāng)溫度超過40℃時(shí)，隨著溫度的升高，蝦青素的得率有所下降，并趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)檫^高溫度可能會(huì)破壞蝦青素的結(jié)構(gòu)，使部分蝦青素分解或者變性，從而降低蝦青素的得率。隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，這種變化趨勢(shì)使得蝦青素提取液的濃度趨于平穩(wěn)。由此可以得出，蝦青素的最適提取溫度為40℃。

2.2.4提取時(shí)間對(duì)蝦青素得率的影響提取時(shí)間對(duì)蝦青素得率有著顯著的影響，時(shí)間過短可能提取不完全，時(shí)間過長(zhǎng)蝦青素的結(jié)構(gòu)容易遭到破壞。由圖7可以看出，提取時(shí)間在20 min的得率最高，20～30 min之間得率變化不顯著，30～50 min之間得率明顯下降。由于本實(shí)驗(yàn)采用的是已破壁的雨生紅球藻粉，加入提取劑后蝦青素能很快地溶出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蝦青素的濃度慢慢趨于穩(wěn)定。如果時(shí)間太長(zhǎng)，蝦青素過久暴露在相對(duì)高溫的提取環(huán)境中，部分蝦青素的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，會(huì)導(dǎo)致得率有所下降。因此，20 min為破壁雨生紅球藻粉中蝦青素的最佳提取時(shí)間。

圖7　不同提取時(shí)間的蝦青素得率Fig.7　Extraction yield of astaxanthin with different extraction time

2.3正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表中可以看出，各因素對(duì)于藻粉中蝦青素得率影響的主次順序?yàn)锽＞D＞C＞A，即料液比對(duì)于蝦青素得率的影響最大，提取時(shí)間和溫度的影響次之，提取溶劑的影響最小。本研究的優(yōu)化組合為A1B1C2D2，即以乙酸乙酯∶乙醇（1∶1）為提取劑，料液比為1∶100，40℃條件下提取20 min。該組合沒有在表3中出現(xiàn)，因此追加驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在此條件下，得率為49.96%，高于A1B2C2D2組合下的49.87%。故最佳的優(yōu)化組合應(yīng)為A1B1C2D2，重復(fù)進(jìn)行最佳組合實(shí)驗(yàn)，平均得率為49.93%，結(jié)果穩(wěn)定。

2.4與幾種其他提取方法的比較

本研究采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化溶劑法提取雨生紅球藻粉中蝦青素，從表4可以看出，就提取過程而言，不需要微波萃取反應(yīng)儀，超臨界CO2萃取裝置等其他設(shè)備，節(jié)省了成本。在低毒性提取溶劑下，本實(shí)驗(yàn)的液料比適中，節(jié)約了提取溶劑，縮短了提取時(shí)間，相比與傳統(tǒng)的溶劑提取法，得率有了明顯的提高。

表3　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析Table 3　Orthogonal test results and analysis

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以低毒高效的方式提取雨生紅球藻中的蝦青素，采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化了提取過程，得出各因素對(duì)得率的影響大小依次為：料液比＞提取時(shí)間＞溫度＞提取溶劑。確定了最優(yōu)提取條件：乙酸乙酯∶乙醇（1∶1）為提取劑、料液比為1∶100、40℃提取20 min，得率為49.96%。

表4　與幾種其他提取方法的比較Table 4　Comparison with some other extraction methods

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Optimization of extraction of astaxanthin from Haematococcus pluvialis on the basis of low toxicity and high efficiency

XU Jian，NI Xiao-feng，SHEN Sheng-rong*
（School of Biosystems Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China）

With the development of application of astaxanthin，the solvent safety had being become more and more important.In the present paper and in order to screen the better method with the low toxicity and high efficiency than used before，a verity of solvents was been investigated.Also，the effects of extracted conditions on the extraction of astaxanthin from Haematococcus pluvialis were analyzed and optimized，such as solidliquid ratio，temperature，extraction time.The orthogonal test results indicated that the most important factor was solid-liquid ratio，followed by extraction time，temperature，solvent in order.Treated the Haematococcus pluvialis with ethylacetate∶ethanol（1∶1）with solid-liquid ratio 1∶100 in water bath（40℃，20 min），the optimal extraction yield of astaxanthin was 49.96%.

Haematococcus pluvialis；astaxanthin；low toxicity and high efficiency；extraction

TS201.1

B

1002-0306（2015）18-0301-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.052

2014－12－22

徐?。?991-），女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：janejianxu@163.com。

沈生榮（1963-），男，博士，教授，研究方向：食品分子營(yíng)養(yǎng)與食品分子影像學(xué)，E-mail：shrshen@zju.edu.cn。