三峽庫區(qū)烏皮香核桃隔膜皂苷提取及抗氧化測定

陳　林，王兆丹，曲留柱，金小勇，王小玉（重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，生物與食品基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心（市級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心），重慶404100）

三峽庫區(qū)烏皮香核桃隔膜皂苷提取及抗氧化測定

陳林，王兆丹，曲留柱*，金小勇，王小玉
（重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，生物與食品基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心（市級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心），重慶404100）

本實(shí)驗(yàn)采用超聲波法，響應(yīng)面設(shè)計(jì)提取三峽庫區(qū)特產(chǎn)核桃隔膜皂苷。結(jié)果顯示核桃隔膜中皂苷提取的最佳提取工藝參數(shù)為：提取功率300 W，提取時(shí)間為96 s，料液比為1∶33（g/mL），皂苷的提取得率為5.98%。通過DPPH，ABTS法對(duì)核桃隔膜皂苷提取物進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)，表明皂苷提取物對(duì)自由基清除效果明顯，有較強(qiáng)的抗氧化活性。

核桃隔膜，皂苷，超聲波提取，響應(yīng)面分析，抗氧化性

核桃隔膜又稱分心木（Juglans regia），為帶骨質(zhì)內(nèi)果皮的種隔，完整呈類圓形或橢圓形，直徑約2.5 cm。表面棕色至褐色，有光澤，邊緣增厚。體輕，質(zhì)脆，易折斷，味微澀。用于腎虛遺精，滑精，遺尿，瀉痢［1-3］。目前國內(nèi)外對(duì)核桃屬植物［4-7］藥用性研究較多，但對(duì)內(nèi)隔膜的研究較少，導(dǎo)致其藥用價(jià)值未能充分認(rèn)識(shí)造成資源浪費(fèi)。

超聲波提取法最大優(yōu)點(diǎn)是節(jié)約能源和時(shí)間。它利用超聲波的空化效應(yīng)［8］，使植物活性成分在不被破壞的情況下溶出，且體系溫度不會(huì)大幅度升高。響應(yīng)面分析方法（response surface methodology，RSM）是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法［9-10］，可用于確定各種因素及其交互作用在工藝過程中對(duì)指標(biāo)（響應(yīng)值）的影響，精確的表述因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)三峽庫區(qū)核桃品種核桃隔膜皂苷提取物工藝學(xué)研究及功能初步測定，以期加深對(duì)其綜合利用。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

核桃隔膜選自重慶城口烏皮香核桃，出油率達(dá)25%，取出核桃隔膜，然后用粉碎機(jī)將其打成粉末，過40目篩；薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品（MUST-10102901）、無水乙醇色譜純。

JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)寧波新基生物科技股份有限公司；FZ102-微型植物粉碎機(jī)天津市泰斯特儀器有限公司；SHZ-95B型循環(huán)水式多用真空泵鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；UV2450型紫外可見光分光光度計(jì)日本島津公司；AL-104電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定準(zhǔn)確稱量薯蕷皂苷樣品5.4 mg，并定容至100 mL，從標(biāo)準(zhǔn)樣品中取出5 mL用70%的乙醇溶液定容至10 mL，依次取樣稀釋配制梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全波長掃描，檢測得出標(biāo)準(zhǔn)品的最佳吸收波長為210 nm，在該波長下檢測梯度標(biāo)準(zhǔn)液的吸光值，根據(jù)得到的吸光值及其溶液濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得線性回歸方程。

1.2.2核桃隔膜皂苷提取方法核桃隔膜粉碎后，用電子天平精確稱量1 g樣品，并按一定料液比加入70%的乙醇溶液進(jìn)行超聲波提取，將提取后的溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮；稀釋后，在210 nm下測定樣品的吸光值A(chǔ)c，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品皂苷提取當(dāng)量，再計(jì)算核桃隔膜皂苷提取得率。

1.2.3回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.2方法測定吸光度值，帶入回歸方程計(jì)算總皂苷含量。

1.2.4單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1提取時(shí)間的確定在超聲波功率為275 W，料液比為1∶30（g/mL）條件下，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)依次提取0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25 min；并計(jì)算皂苷提取得率，確定提取得率隨提取時(shí)間的變化趨勢。

1.2.4.2提取功率的確定在料液比為1∶30（g/mL），提取1.5 min，設(shè)置功率為175、200、225、250、275、300、325、350 W分別提取，并計(jì)算皂苷提取得率，確定提取得率隨提取功率的變化趨勢。

1.2.4.3料液比的確定在超聲波功率為275 W，料液比依次為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45（g/mL）的條件下，提取1.5 min，并計(jì)算皂苷提取得率，確定提取得率隨提取料液比的變化趨勢。

1.2.5響應(yīng)面試驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上分別以提取功率、提取時(shí)間及料液比3個(gè)因素為考察對(duì)象，以皂苷提取得率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)分析進(jìn)行提取條件的優(yōu)化。

表1　核桃隔膜皂苷提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1　Factors and levels of central composite test on extraction of saponins

1.2.6核桃隔膜對(duì)DPPH自由基清除作用準(zhǔn)確移取3.9 mL 25.61 mg/L的DPPH溶液，加入0.1 mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液，混勻，在517 nm波長處測吸光度（Ac）。將各待測樣品用相應(yīng)的提取溶劑配成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/mL，分別準(zhǔn)確移取0.1 mL不同濃度的各樣品溶液，加入3.9 mL DPPH溶液（25.61 mg/L），混合均勻，室溫避光反應(yīng)30 min后于517 nm處測定吸光度（Ai）。同時(shí)測定3.9 mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液中加入0.1 mL不同濃度樣品溶液的吸光度（Aj）［11］，以BHT作為陽性對(duì)照。DPPH清除率按以下公式計(jì)算：

1.2.7核桃隔膜對(duì)ABTS自由基清除作用取5.0 mL 7 mmol/L的ABTS+溶液，加入88.0 μg 140 mmol/L的過硫酸鉀在室溫下置于暗處反應(yīng)12～16 h，形成ABTS+自由基儲(chǔ)備液。在734 nm處，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇將ABTS+自由基儲(chǔ)備液稀釋至吸光度為0.70±0.02備用。準(zhǔn)確量取0.1 mL濃度10、20、40、80、160 μg/mL的樣品溶液，加入3.9 mL ABTS+溶液，混勻，在室溫下反應(yīng)6 min后734 nm處測定吸光度AE［12-14］。同時(shí)吸取3.9 mL ABTS+溶液，加入0.1 mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液于734 nm處測定吸光度AB。ABTS自由基清除率計(jì)算公式如下：

1.2.8數(shù)據(jù)處理每一組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次計(jì)算平均值。單因素及抗氧化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007統(tǒng)計(jì)并作初步處理，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用軟件SAS 9.2對(duì)數(shù)據(jù)分析處理并繪制響應(yīng)曲面和等高線。

2　結(jié)果與討論

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

將配制好的不同濃度薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照溶液在210nm波長處測定吸光度A，得到回歸方程Y= 2.548X-0.003，R2=0.9995。表明皂苷濃度在0.005～0.0135 mg/mL范圍內(nèi)線性良好。

2.2回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.3方法測定皂苷回收率為99.29%±0.07%，由此可見該標(biāo)曲具有很高的可靠度，可用于皂苷含量的檢測。

2.3核桃隔膜皂苷提取的單因素實(shí)驗(yàn)

圖1～圖3分別為不同提取功率、提取時(shí)間及料液比下核桃隔膜皂苷的提取得率。隨著超聲波功率的增加，得率呈增加趨勢，且在275 W達(dá)到最大，之后得率隨功率的增加呈下降趨勢。

超聲功率275 W，料液比1∶30的條件下，核桃隔膜皂苷提取得率呈先增加后下降趨勢。當(dāng)提取時(shí)間超過1.5 min，皂苷溶解度達(dá)到飽和狀態(tài)，皂苷提取得率反而逐漸下降。隨著超聲時(shí)間延長，植物細(xì)胞被破壞，內(nèi)容物流出影響皂苷提取得率，故此條件下提取1.5 min提取得率最高。

圖1　不同提取功率對(duì)隔膜皂苷提取得率的影響Fig.1　Effect of extraction power on the extraction efficiency of extraction rate

圖2　不同提取時(shí)間對(duì)隔膜皂苷提取得率的影響Fig.2　Effect of extraction time on the extraction efficiency of extraction rate

圖3　不同料液比對(duì)隔膜皂苷提取得率的影響Fig.3　Effect of extraction material/liquid ratio on the extraction efficiency of extraction rate

超聲功率275 W，提取時(shí)間1.5 min的條件下，料液比從1:10提高到1:30時(shí)，提取得率從0.372%增加到2.05%，進(jìn)一步提高料液比，提取得率下降。

2.4響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

超聲波輔助提取核桃隔膜皂苷的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，回歸模型的方程為：

對(duì)該響應(yīng)面回歸模型進(jìn)行方差分析（表3）。從此模型的方差分析表可知，響應(yīng)面回歸模型達(dá)到極顯著水平（p=0.0013＜0.05），復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為0.9251，說明該二次模型能夠擬合真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)誤差小。

表2　核桃隔膜皂苷提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2　Experimental design and result of central composite test on extraction of saponins

表3　回歸方程的方差分析表Table 3　Analysis of variance of the regression model

表4　二次多項(xiàng)式回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 4　Regression coefficients of predicted quadratic polynomial model

從二次多項(xiàng)式回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果（表4）可知，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，對(duì)結(jié)果影響因素大小順序?yàn)椋禾崛r(shí)間、提取功率、料液比。由顯著性檢驗(yàn)可知，其中對(duì)Y的影響極顯著（p＜0.01），X1、X2、X3、X12對(duì)Y的影響顯著（p＜0.05），X1X2、X1X3、X2X3對(duì)Y的影響不顯著。

圖4　因素交互作用對(duì)核桃隔膜皂苷提取得率影響的響應(yīng)曲面Fig.4　Response surface plots for the effects of process parameter on the extraction efficiency of saponins

表5　烏皮香核桃提取物清除DPPH、ABTS自由基能力Table 5　Antioxidant effect and scavenging capacity against DPPH、ABTS+of Wu walnut

根據(jù)回歸方程做出響應(yīng)面圖（圖4）可直觀反映出各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。由圖4可知，各因素之間的交互作用對(duì)核桃隔膜皂苷提取得率均具有一定的影響，但均不顯著。

由SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件分析得到響應(yīng)值Y的最大估計(jì)值為5.98%，此時(shí)提取功率、提取時(shí)間、料液比對(duì)應(yīng)的編碼值分別為X1=0.606882、X2=0.106907、X3=0.160032，即提取功率300.978 W，提取時(shí)間為1.590 min，料液比為1∶32.689。為實(shí)驗(yàn)方便性選擇提取功率300 W，提取時(shí)間為96 s，料液比為1∶33（g/mL），對(duì)核桃隔膜皂苷提取進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到實(shí)際提取得率為5.83%，與預(yù)測值非常接近，相對(duì)誤差為2.5%。

2.5烏皮香核桃隔膜抗氧化性分析

DPPH·是一種以氮為中心的穩(wěn)定紫色自由基，在620 nm處有強(qiáng)吸收。ABTS與一定濃度的過硫酸鉀在暗處反應(yīng)12～16 h經(jīng)活性氫氧化生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽離子自由基ABTS+，若加入具有抗氧化活性物質(zhì)會(huì)與之發(fā)生褪色反應(yīng)［15］。核桃隔膜皂苷的抗氧活活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。從表5可以看出，核桃隔膜提取物對(duì)自由基清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，呈一定的線性關(guān)系，R2分別為0.8915和0.9938。

3　結(jié)論

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用了3因素3水平的響應(yīng)面分析方法，對(duì)核桃隔膜皂苷的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定核桃隔膜中皂苷最佳提取工藝參數(shù)為：提取功率300 W，提取時(shí)間為96 s，料液比為1:33（g/mL）。在此條件下測得的實(shí)際提取得率為5.83%，與預(yù)測值的相對(duì)誤差為2.5%。同時(shí)得到了核桃皂苷提取得率與各因素變量的二次多項(xiàng)式回歸方程，該模型回歸極顯著，實(shí)驗(yàn)擬合較好。因此利用響應(yīng)面法優(yōu)化核桃隔膜皂苷提取條件是可行的?？寡趸钚詫?shí)驗(yàn)表明，核桃皂苷對(duì)自由基清除效果明顯，有較強(qiáng)的抗氧化活性，核桃隔膜提取物對(duì)自由基清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，呈一定的線性關(guān)系，R2分別為0.8915和0.9938。

［1］郗容庭，張毅萍.中國核桃［M］.北京：中國林業(yè)出版社，1992.

［2］全國中草藥匯編編寫組.中藥大辭典：上冊(cè)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1975：667.

［3］景援朝，趙煥新，白虹.分心木的研究進(jìn)展［J］.藥學(xué)研究，2014（3）：167-169.

［4］李福雙，申健，譚桂山.胡桃屬植物化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.中成藥，2007，29（10）：1490-1495.

［5］楊明珠，田新雁，肖朝江，等.核桃分心木化學(xué)成分與生物［6］王艷，迪麗達(dá)爾·馬合木提，韓艷春，等.維吾爾藥核桃分心木不同提取物對(duì)腎陽虛模型小鼠的實(shí)驗(yàn)研究［J］.新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012（2）：153-157.

活性研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012，12：1707-1711，1728.

［7］于海玲.核桃楸的研究進(jìn)展［J］.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào)，2005，28（2）：154-156.

［8］胡愛軍，羅登林，丘泰球.超聲強(qiáng)化超臨界流體萃取機(jī)理的研究［J］.高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào)，2005，05：11-15.

［9］LI Quanhong，F(xiàn)U Caili.Aplication of response surface methodology for extraction optimization of germinant pumpkin seeds protein［J］.Food Chemistry，2005，92（4）：701-706.

［10］茆詩松，王靜龍，史定華，等.統(tǒng)計(jì)手冊(cè)［M］.北京：科學(xué)出版社，2003：78-86.

［11］Sun Ting，Ho CT.Antioxidant activities of buckwheat extractsp［J］.Food Chemistry，2005，90：743-749.

［12］St phanie Dudonm，Xavier Vitrac，Philippe Coutire，et al. Comparative study antioxidant properties and total phenolic of 30 plant extracts of industrial interest using DPPH，ABTS，F(xiàn)RAP，SOD，and ORAC assays［J］.J Agric Food Chem，2009，57：1768-1774.

［13］Fang ZX，Zhang YH，Yuan L，et al.Phenolic compounds and antioxidant capacities of bayberry juices［J］.Food Chemistry，2009，113：884-888.

［14］Yvonne V Yuan，Dawn E Bone，Meshell F Carrington. Antioxidant activity of dulse（Palmaria palmata）extract evaluated invition［J］.Food Chemistry，2005，91：485-494.

［15］劉春紅，馬宇，何忠梅，等.平貝母多糖的分離純化及抗氧化活性研究［J］.食品科學(xué)，2011，32（21）：2-33.

Antioxidant activity of ultrasonic extraction isolates from three gorges reservoir area Juglans regia of Wu walnut

CHEN Lin，WANG Zhao-dan，QU Liu-zhu*，JIN Xiao-yong，WANG Xiao-yu
（Biotechnology and Food Basic Experimental Teaching Center（Municipal Experimental Teaching Demonstration Center）College of Life Science and Engineering，Chongqing Three Gorges University，Chongqing 404100，China）

The total saponins were examined in the dissepiment of Wu walnut.On the basis of single factor experiments with the method of ultrasonic-assisted extraction，optimal parameters of extraction process was researched by using response surface method.A mathematical model including material/liquid ratio，ultrasonic treatment time and extraction temperature was created.By typicality analysis，the optimum process conditions were as follows：the ultrasonic treatment time was 96 s，the ultrasonic power was 300 W and the material/liquid ratio was 1∶33（g/mL）.Under such conditions，an optimal total saponins yield of 5.98%was obtained.Saponins displayed strong antioxidant effect and scavenging capacity against DPPH，ABTS radical，and more strengthen with the increase in the concentration of total crude saponins extract.

Juglans regia；saponins；ultrasonic extraction；response surface method；antioxidant

TS201.1

B

1002-0306（2015）18-0248-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.041

2014－12－23

陳林（1986-），女，碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事食品化學(xué)，天然產(chǎn)物提取及活性方面的研究，E-mail：friendlin@126.com。

曲留柱（1984-），男，博士，主要從事食品科學(xué)方面的研究，E-mail：103881829@qq.com。

重慶市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（CSTC2009BB5236）；12科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)三峽庫區(qū)農(nóng)產(chǎn)品綠色保鮮技術(shù)；2014年重慶三峽學(xué)院科學(xué)研究青年資助項(xiàng)目（14QN26）。