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    基于λ核酸外切酶輔助放大的化學發(fā)光傳感器用于DNA的靈敏檢測

    2015-11-03 07:25陳佳等
    分析化學 2015年10期

    陳佳等

    摘 要 基于G-四鏈體/血紅素 DNA酶的高催化活性以及λ核酸外切酶(λexo)的輔助放大功能,以17個堿基的DNA片段作為模型分析物,構建了一種快速、靈敏、特異性好的新型Luminol-H2O2-G-四鏈體/血紅素 DNA酶化學發(fā)光傳感體系。考察了λexo用量、Luminol濃度、H2O2濃度、溶液pH值對體系化學發(fā)光強度的影響。在最佳實驗條件下,即:pH=9.0,10 units λexo, 1.0×103 mol/L Luminol,3.0 × 102 mol/L H2O2,測得DNA在2.0×1012~8.0×109 mol/L的濃度范圍內(nèi)與Luminol的相對化學發(fā)光強度之間呈現(xiàn)良好的線性關系,檢出限(3σ)為0.7×1013 mol/L。本方法可以區(qū)分不同錯配的核酸序列,并可用于復雜生物樣品的分析。

    關鍵詞 λ核酸外切酶;G-四鏈體/血紅素DNA酶;化學發(fā)光;DNA

    1 引 言

    DNA是生物體遺傳信息的載體[1],構建快速、靈敏、高選擇性的生物分析新方法用于低豐度的DNA序列的檢測在臨床診斷、基因篩選、食品和環(huán)境監(jiān)測、國土安全等方面起著至關重要的作用[2,3]。近年來,信號放大已經(jīng)成為提高DNA檢測靈敏度的重要手段,如采用納米材料作為信號放大的標記物、采用聚合酶鏈反應(PCR)或者滾環(huán)擴增(RCA)等核酸擴增技術等。雖然這些方法大大提高了檢測的靈敏度,但是也存在操作繁瑣、費時、價格昂貴、易出現(xiàn)假陽性信號等缺陷[4,5]。使用限制性內(nèi)切酶進行信號放大的方法,較以往的信號放大方法更為簡單、快速,但是由于限制性內(nèi)切酶只能針對特定的DNA序列,在實際應用中存在一定的局限性[6,7]。因此,發(fā)展快速、靈敏的DNA測定新方法具有重要的理論和實際意義[8]。

    λ核酸外切酶(Lambda exonuclease,λexo)是一種高持續(xù)性核酸外切酶,能夠催化雙鏈DNA分子自5′磷酸末端→3′方向逐步水解,并釋放出5′-單核苷酸,進而將雙鏈DNA變成單鏈DNA[9,10]。λexo在核酸重組、復制、分型、基因修復以及分子克隆等方面起著至關重要的作用,已成為研究基因組成、功能及表達的重要工具之一。此外,許多研究者將λexo的獨特性質應用于核酸探針的信號放大技術,以實現(xiàn)核酸、蛋白質等生物分子的超靈敏檢測[11~14]。但是這些方法大多需要對核酸探針進行熒光標記,過程復雜且成本較高。

    G-四鏈體/血紅素 DNA酶(G-Quadruplexes/hemin DNAzyme)是一種具有催化性能的人工模擬酶,由富含鳥嘌呤堿基的核酸分子與血紅素結合,形成穩(wěn)定的G-四鏈體結構,表現(xiàn)出類似于辣根過氧化物酶的活性,能夠催化H2O2氧化2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)產(chǎn)生顏色變化或者催化H2O2氧化魯米諾(Luminol)產(chǎn)生化學發(fā)光[15~17],在生化分析領域已經(jīng)引起研究者的廣泛關注[18]。

    化學發(fā)光(Chemiluminescence, CL)分析由于不需要激發(fā)光源,避免了背景光和雜散光的干擾,大大提高了信噪比,具有靈敏度高、線性范圍寬、分析速度快、儀器設備簡單等優(yōu)勢,目前已廣泛應用于免疫分析、臨床檢驗、環(huán)境檢測、物質分析等領域[19~22]。本研究采用3條核酸鏈構建DNA夾心結構,使用λexo進行目標DNA的輔助放大,建立了新型化學發(fā)光傳感器,成功實現(xiàn)了DNA檢測。本方法具有操作簡單、靈敏度高、特異性好等優(yōu)勢,可用于實際樣品分析。

    2 實驗部分

    2.1 儀器與試劑

    LS-55型發(fā)光光度計(美國Perkin-Elmer公司);PHSJ-4A型pH計(上海精密科學儀器有限公司)。

    所有DNA片段均由上海生工生物有限公司提供(序列見表1)。Luminol、H2O2(國藥上海試劑公司);血紅素(Hemin)、N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)購于美國Sigma公司;λ核酸外切酶(Lambda exonuclease,λexo)、10×λexo反應緩沖液(0.67 mol/L Glycine-KOH(pH 9.4,25℃),0.02 mol/L MgCl2,500 μg/mL BSA)購于美國New England Biolabs公司。其它試劑均為國產(chǎn)分析純,實驗用水為18.2 MΩ·cm的超純水。2.5 × 102 mol/L HEPES-NH4OH緩沖液(pH=7.4/8.0/8.5/9.0/9.5/10.0),含0.05%(w/V)Triton X-100,1%(V/V)DMSO,2.0×102 mol/L KCl和0.2 mol/L NaCl。

    2.2 實驗方法

    2.2.1 DNA的檢測 將濃度均為1.0×105 mol/L的Auxiliary DNA、Phosphate-DNA、Hairpin DNA溶液以及不同濃度的Target DNA在95℃下加熱10 min,再自然冷卻到室溫。

    取出20 μL不同濃度的Target DNA與10 μL Auxiliary DNA、10 μL Phosphate-DNA,在37℃雜交2 h;雜交完成后,加入5 μL λexo (2 U/μL)及5 μL 10 × λexo反應緩沖液,在37℃下溫育30 min。隨后,將上述混合溶液加熱到75℃,保持10 min,再冷卻至37℃,孵育1 h;加入10 μL Hairpin DNA,在37℃孵育30 min,再向上述混合溶液中加入20 μL Hemin(終濃度為2.0×107 mol/L)及820 μL HEPES-NH4OH緩沖溶液,充分混勻后,在室溫下孵育1 h,保證Hemin與打開的Hhairpin DNA充分反應,形成穩(wěn)定的G-Quadruplexes/hemin DNAzyme結構。最后,依次將50 μL Luminol(終濃度為1.0×103 mol/L)、50 μL H2O2(終濃度為3.0×102 mol/L)加入到上述溶液中,在室溫下立即測量樣品的CL光譜。

    2.2.2 化學發(fā)光測定

    CL測量均使用光程為1 cm的比色池。電壓設置為800 V,狹縫寬度設為15 nm,掃描速度為1200 nm/min,測量時關掉LS-55型發(fā)光光度計的氙燈,測定樣品溶液在425 nm處的相對化學發(fā)光強度ΔI(ΔI=I-I0, I0為無Target DNA存在時Luminol的化學發(fā)光強度, I為不同濃度的Target DNA存在時Luminol的化學發(fā)光強度)。每個樣品均平行測定3次。

    3 結果與討論

    3.1 實驗原理

    實驗原理如圖1所示,本體系包括4種DNA:Target DNA、Phosphate-DNA、Auxiliary DNA、Hairpin DNA。首先,Phosphate-DNA與AuxiliaryDNA及Target DNA進行雜交,形成DNA的復合結構。隨后向溶液中加入λexo,由于λexo可作用于5′磷酸化的雙鏈DNA分子,并沿5′-3′方向漸進性催化去除5′單核苷酸,破壞雙鏈DNA結構,同時釋放出Auxiliary DNA及Target DNA。釋放出的Target DNA可以繼續(xù)進入下一輪循環(huán),不斷產(chǎn)生大量Auxiliary DNA,而Auxiliary DNA可以將Hairpin DNA的莖環(huán)結構打開,打開的Hairpin DNA在血紅素存在的條件下,可以形成穩(wěn)定的G-Quadruplexes/HeminDNAzyme結構,表現(xiàn)出類似于過氧化物酶的活性,能夠催化H2O2氧化Luminol產(chǎn)生化學發(fā)光,并且Luminol產(chǎn)生的相對化學發(fā)光強度與目標DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成比例,從而可以實現(xiàn)Target DNA的定量分析檢測。

    3.2 可行性研究

    不同條件下的化學發(fā)光光譜(圖2) 表明,單獨的Hemin化學發(fā)光強度十分微弱(曲線a);不加入Target DNA(曲線b), 或者不加入λexo(曲線c)的情況下,體系的化學發(fā)光強度也較弱; 圖2 不同體系的化學發(fā)光光譜

    Fig.2 CL spectra of hemin (a), phosphate-DNA/auxiliary DNA/hairpin DNA/λexo/hemin (b), phosphate-DNA/auxiliary DNA/hairpin DNA/target DNA/hemin (c) and phosphate-DNA/auxiliary DNA/hairpin DNA/target DNA/λexo/hemin (d and e). Experimental conditions: 1.0×107 mol/L phosphate-DNA, 1.0×107 mol/L auxiliary DNA, 1.0×107 mol/L hairpin DNA, 5.0×1012 mol/L target DNA(curve d) and 8.0×109 mol/L target DNA(curve c and e), 2.0×107 mol/L hemin, 10 units lambda exonuclease (λexo), 1.0×103 mol/L Luminol, 3.0×102 mol/L H2O2加入λexo及Target DNA后,體系的化學發(fā)光強度增加,且Target DNA濃度越高,發(fā)光強度越高(曲線d和e)?;瘜W發(fā)光強度的增加是由于λexo催化水解磷酸化5′末端,釋放Target DNA,并不斷進入下一循環(huán),產(chǎn)生大量的Auxiliary DNA,可以與Hairpin DNA形成大量的G-Quadruplexes/hemin DNAzyme結構。上述結果表明,本方法可用于Target DNA檢測。

    3.3 測定條件的優(yōu)化

    3.3.1 λexo用量對體系化學發(fā)光強度的影響 由于λexo用量直接影響目標DNA的循環(huán)效果,進而影響檢測體系的化學發(fā)光信號的強弱,因此實驗首先考察了λexo用量對體系化學發(fā)光強度的影響(圖3),結果表明,體系的化學發(fā)光強度隨著λexo用量的增加而逐漸增強,并且當λexo的用量達到10 units 時,體系的化學發(fā)光強度趨于穩(wěn)定。因此,實驗將λexo的最佳用量定為10 units。

    3.3.2 pH值對體系化學發(fā)光強度的影響 由于體系的化學發(fā)光強度與緩沖介質的pH值之間存在一定關系[6,16],因此考察了不同pH條件對體系化學發(fā)光強度的影響。實驗結果如圖4所示,所用HEPES-NH4OH緩沖溶液使體系pH值從7.4逐漸增加到9.0時,體系的化學發(fā)光強度逐漸增強,且在pH=9.0時達到最大值;之后繼續(xù)增大pH值,體系的化學發(fā)光強度逐漸減弱。最終選擇pH=9.0的HEPES-NH4OH緩沖溶液作為最佳緩沖條件。

    3.3.3 Luminol濃度對體系發(fā)光強度的影響 作為化學發(fā)光的底物,Luminol的濃度強烈影響體系的化學發(fā)光強度。本研究考察了不同濃度的Luminol對體系化學發(fā)光強度的影響,實驗結果如圖5所示。在0.4~1.0 mmol/L的濃度范圍內(nèi),隨著Luminol濃度的增加,體系的化學發(fā)光強度逐漸增強,且在Luminol濃度為1.0×103 mol/L時,發(fā)光強度達到最大值;之后繼續(xù)增大Luminol的濃度,體系的化學發(fā)光強度反而呈現(xiàn)下降趨勢。因此選擇Luminol的最佳濃度為1.0 mmol/L。

    3.3.4 H2O2濃度對體系化學發(fā)光強度的影響 考察了化學發(fā)光的氧化試劑H2O2的濃度對體系化學發(fā)光強度的影響示。從圖6可見,H2O2濃度在5.0~30 mmol/L范圍內(nèi),隨著H2O2濃度增加,體系的化學發(fā)光強度逐漸增強;當H2O2濃度在30~50 mmol/L時,體系的化學發(fā)光強度逐漸減弱。為了獲得較大的化學發(fā)光強度,實驗選擇H2O2的最佳濃度為30 mmol/L。

    3.4 靈敏度的考察

    在優(yōu)化的實驗條件下,測定目標 DNA濃度與體系的化學發(fā)光強度之間的關系(圖7和圖8)。從圖7可見, Luminol的化學發(fā)光強度隨著目標DNA濃度的增加而不斷增強,并且Luminol的相對化學發(fā)光強度ΔI與目標DNA在2.0×1012~8.0×109 mol/L濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系(圖8),檢出限為0.7×1013 mol/L(3σ)。與文獻報道的方法比較(表2)可見,本方法的靈敏度優(yōu)于文獻報道的光學檢測方法, 或與之相當。

    3.5 特異性的考察

    為考察所建立方法的特異性,選擇濃度均為8.0×108 mol/L的隨機序列DNA片段、單堿基錯配的DNA片段, 以及三堿基錯配的DNA片段作為對照樣品,與8.0×109 mol/L目標DNA進行分析比較。從圖9可見,僅有完全互補的目標DNA存在時,才能使體系的化學發(fā)光強度顯著增加;相比之下,其它幾種DNA的化學發(fā)光強度很低。結果表明,構建的化學發(fā)光傳感器具有很好的特異性,可以區(qū)分不同錯配的DNA序列。

    3.6 實際樣品的測定

    為了考察所建立的方法檢測復雜生物樣品的可行性,進行了人血清樣品中的標準添加實驗。人血清樣品稀釋100倍進行加標分析。從圖10可見,目標DNA在人血清樣品中的化學發(fā)光強度值與其在緩沖溶液中的化學發(fā)光強度值基本一致,表明通過樣品稀釋可以有效降低復雜樣品的基質的影響。結果表明,本方法在復雜生物樣品的分析方面具有潛在的應用價值。

    4 結 論

    本研究發(fā)展了一種基于λexo輔助放大和G-Quadruplexes/hemin DNAzyme催化放大的簡單、快速的傳感新方法,成功實現(xiàn)了目標DNA在緩沖溶液和復雜生物樣品中的高靈敏檢測。本方法具有獨特的優(yōu)勢:與傳統(tǒng)的光學分析方法相比,本方法不需要標記任何發(fā)光基團,分析成本低;整個檢測過程都是在均相溶液中進行,無需經(jīng)過洗滌、分離等繁瑣的操作步驟,簡單方便;本方法具有很高的靈敏度和特異性;本方法對目標DNA的檢測具有良好的通用性,通過改變Phosphate-DNA的堿基序列很容易應用于其它目標DNA的檢測,具有潛在的應用價值。

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