蛋白質(zhì)表達(dá)譜在選擇性COX-2抑制劑中抗癌作用的機(jī)制研究

朱天吉，張　卿

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，內(nèi)蒙古呼和浩特010050）

·基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)·

蛋白質(zhì)表達(dá)譜在選擇性COX-2抑制劑中抗癌作用的機(jī)制研究

朱天吉，張卿

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，內(nèi)蒙古呼和浩特010050）

目的：為了確定蛋白質(zhì)表達(dá)譜在選擇性COX-2抑制劑尼美舒利（NIM）抗肺癌的作用，本研通過(guò)運(yùn)用二維凝膠電泳，質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)技術(shù)研究尼美舒利對(duì)肺癌蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，分離并鑒定其相關(guān)蛋白質(zhì).方法：建立肺腺癌裸鼠移植瘤模型并進(jìn)行尼美舒利藥物干預(yù)，應(yīng)用雙向電泳技術(shù)對(duì)尼美舒利組和對(duì)照組的裸鼠移植瘤的總蛋白進(jìn)行分離，利用PDQUEST7.2軟件分析差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定.結(jié)果：通過(guò)雙向電泳-圖像分析-質(zhì)譜技術(shù)確定了14個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中11個(gè)蛋白質(zhì)在尼美舒利組顯著下調(diào)，3種蛋白質(zhì)顯著上調(diào).結(jié)論：質(zhì)譜鑒定得到的這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)對(duì)確定尼美舒利抗肺癌作用的機(jī)制有一定指導(dǎo)意義，為進(jìn)一步研究其抗腫瘤作用奠定良好的基礎(chǔ).

肺腺癌；裸鼠移植瘤；蛋白質(zhì)組學(xué)；質(zhì)譜分析

0 引言

相關(guān)資料顯示，肺癌無(wú)論是年發(fā)病率還是年死亡率，均居全球癌癥首位.過(guò)去生物學(xué)和醫(yī)學(xué)對(duì)于癌癥的研究主要集中在基因水平和轉(zhuǎn)錄水平，而腫瘤是由環(huán)境因素和遺傳因素相互作用的多種基因和蛋白質(zhì)參與的疾病，是由某些蛋白質(zhì)的表達(dá)或者變化引起的一系列細(xì)胞無(wú)限增殖過(guò)程，所以蛋白質(zhì)對(duì)于腫瘤的研究至關(guān)重要［1-2］.蛋白質(zhì)組是指一個(gè)組織、細(xì)胞或基因組在一個(gè)時(shí)期內(nèi)所表達(dá)的所有蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)組學(xué)就是對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行研究的學(xué)科，它最早是由澳大利亞Macquarie大學(xué)的Wilkins和Williams在1994年提出的［3］.蛋白質(zhì)組學(xué)的提出為我們研究腫瘤發(fā)生和治療的分子機(jī)制提供了新的思路.

本研究以尼美舒利（nimesulide，NIM）干預(yù)肺腺癌A549細(xì)胞接種的裸鼠移植瘤為研究對(duì)象，采取比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)，以雙向凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，用圖像分析技術(shù)尋找差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，篩定出尼美舒利干預(yù)后肺腺癌裸鼠移植瘤中的差異蛋白質(zhì)，為研究肺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移機(jī)制及治療提供線(xiàn)索和依據(jù).

1 材料和方法

1.1細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 人腺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自南京博爾生物有限公司.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB-C裸鼠，共20只，雌性，4～6周，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，層流凈化室內(nèi)飼養(yǎng)，接種前體質(zhì)量18～20 g.

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基：購(gòu)自德國(guó)Applichem公司；胎牛血清：GIBCO公司；胰蛋白酶：GIBCO公司產(chǎn)品；二甲基亞砜（DMSO）分析純：Sigma公司；青霉素、鏈霉素：華北制藥有限公司；PBS緩沖液：南京博爾迪生物科技有限公司；羧甲基纖維素鈉（CMC）：河北省大城縣新豐纖維素廠(chǎng)；尼美舒利（Nimesulide，NIM）：Sigma公司；蛋白定量試劑盒：碧云天生物技術(shù)研究所；2-D Clean-up Kit試劑盒：GE Healthcare Bio-Sciences公司；IPG Buffer：GE Healthcare Bio-Sciences公司；IPG膠條（pH3～10，線(xiàn)性，13 cm）：GE Healthcare Bio-Sciences公司.

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及裸鼠成瘤 用含10％胎牛血清、100 u/mL青霉素及鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基將肺腺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺腺癌A549細(xì)胞，以108個(gè)/mL密度懸于PBS中.每只裸鼠皮膚消毒后將1 mL PBS細(xì)胞懸浮液接種于左側(cè)背部皮下.將裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n=10）和實(shí)驗(yàn)組（尼美舒利組，n=10），實(shí)驗(yàn)組每天每只給予0.2 mL尼美舒利60 mg/0.2 mL·kg-1溶于5％CMC灌胃，對(duì)照組給予0.2 mL0.5％羧甲基纖維素鈉灌胃，用藥21 d.21 d后斷頸處死各組裸鼠，完整分離切下移植瘤.

應(yīng)用雙向電泳技術(shù)對(duì)尼美舒利組和對(duì)照組的裸鼠移植瘤的總蛋白進(jìn)行分離，利用PDQUEST7.2軟件分析差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定.將移植瘤組織置于-20℃預(yù)冷后的研缽中，在液氮條件下將組織研磨成精細(xì)粉末，置于1.5 mL的EP管中，加入裂解液（100 mg/500μL），同時(shí)加入1 mM PMSF（100 Mm PMSF，10μL）、2 mM EDTA（200 mM EDTA，10 uL），室溫下靜置至少1 h，冰浴超聲前加入100 mM DTT 10μL，超聲5 min（超1 s，隔2 s），-20℃條件下靜置過(guò)夜.次日在4℃條件下，以20 000 g的離心力離心30 min，取上清液即為總蛋白質(zhì)，然后用2-D Clean-up Kit試劑盒（按照試劑說(shuō)明）純化蛋白質(zhì)，再用改良的Bradford法測(cè)蛋白質(zhì)濃度后制成溶解樣品即水化液（蛋白上樣量650μg，液體量250μL）.將溶解樣品移入標(biāo)準(zhǔn)性膠條陽(yáng)極端，在IPG膠條上覆蓋1 mL Immobiline Drystrip覆蓋油，蓋上蓋子，將其尖端背面電極與IPGphor儀器的陽(yáng)極平臺(tái)接觸，飽脹和等電聚焦均在20℃下自動(dòng)進(jìn)行，水化11 h左右，加電壓聚集，等電聚焦電泳結(jié)束后，用鑷子夾住膠條的正極，用去離子水洗掉覆蓋油，用濾紙吸凈離子水，放入DTT平衡液的試管內(nèi)，支持膜貼管壁，置搖床平衡10min，然后加入碘乙酰胺平衡液中，置搖床平衡15 min，去除多余的DTT，取出膠條后用SDS電極緩沖液沖洗膠條，再在Ettan DALTⅡ灌膠槽中制備2塊PAGE膠，把膠條放在玻璃板之間的凝膠上，吸干電極緩沖液，用0.5％的瓊脂糖封頂.垂直電泳在Ettan DALTⅡ電泳槽中進(jìn)行，當(dāng)運(yùn)行溴酚藍(lán)達(dá)到距膠條的底線(xiàn)1 cm時(shí)停止電泳.把二廂結(jié)束的膠進(jìn)行固定、染色、固定、脫色，至蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰.利用Proxpress2D蛋白凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像掃描，然后用PDQUEST7.2軟件對(duì)掃描的圖像進(jìn)行分析，質(zhì)譜鑒定在華大基因研究所完成.

2 結(jié)果

2.1成功構(gòu)建人肺腺癌裸鼠移植瘤模型 接種肺腺癌A549細(xì)胞后，3 d左右開(kāi)始成瘤，瘤體逐漸增大，成瘤率達(dá)100％.移植瘤呈圓形、卵圓形或結(jié)節(jié)型，初期瘤體表面光滑，但隨著瘤體逐漸增大，部分瘤體表面破潰、結(jié)痂.移植瘤裸鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好，飲食及活動(dòng)正常，無(wú)其他明顯不良反應(yīng).

2.2雙向電泳圖譜 尼美舒利組和對(duì)照組各選定一塊蛋白質(zhì)點(diǎn)顯示比較均勻、雜質(zhì)斑點(diǎn)少、最能體現(xiàn)該組蛋白質(zhì)分布狀態(tài)的一塊凝膠.差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的選擇借助圖像分析軟件進(jìn)行匹配，以所選的膠為基準(zhǔn)，參考其他膠，選擇組間表達(dá)差異明顯、組內(nèi)表達(dá)含量穩(wěn)定、位置恒定的點(diǎn)作為目標(biāo)點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其中有14個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，11個(gè)蛋白質(zhì)在尼美舒利組顯著下調(diào)，其中5種蛋白質(zhì)與腫瘤有關(guān)，它們是Rho GTPase、alpha-globin、beta-globin、heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1、Serpin 9d，有1種蛋白質(zhì)為unnamed protein product；3種蛋白質(zhì)在尼美舒利組顯著上調(diào)，它們是tropomyosin 1（TM1）、tropomyosin 2（TM2）和Myosin light chain 1（MLC1）（圖1、圖2）.

A：尼美舒利組；B：正常對(duì)照組圖1　肺腺癌裸鼠移植瘤總蛋白雙向電泳圖譜

圖2　經(jīng)PDQuest軟件分析獲得的肺腺癌裸鼠移植瘤組織雙向電泳差異蛋白

2.3差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的MALDI-TOP-TOP-MS肽質(zhì)量指紋圖譜分析 切取平行膠上14個(gè)相應(yīng)的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，經(jīng)膠內(nèi)原位酶解后用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOP-TOP-MS）分別對(duì)其肽指紋進(jìn)行測(cè)定，并以酶自動(dòng)降解（m/z=1993. 9772）進(jìn)行校正，搜索數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.matrixcience. com/）鑒定得到這些差異蛋白的相關(guān)信息（表1）.

表1　差異蛋白的質(zhì)譜分析結(jié)果

3 討論

尼美舒利是有機(jī)酸類(lèi)非甾體類(lèi)消炎藥，除臨床上用于抗炎及風(fēng)濕性疾病等的治療外，已有眾多的流行病學(xué)資料、體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明尼美舒利具有防治腫瘤的作用［4-6］.目前非甾體類(lèi)消炎藥抗腫瘤作用分子機(jī)制的研究多處于基因水平，在蛋白質(zhì)方面的研究較少，且多數(shù)是單個(gè)基因或蛋白質(zhì)的研究，雖然調(diào)控生命活動(dòng)的源頭是基因，但蛋白質(zhì)才是生命活動(dòng)的具體執(zhí)行者和體現(xiàn)者.蛋白質(zhì)學(xué)的研究大致分為兩類(lèi)，一類(lèi)是結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)研究，主要目的是查清人類(lèi)基因所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，建立蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，另一類(lèi)是差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究，即通過(guò)尋找兩個(gè)或多個(gè)樣本之間蛋白質(zhì)差異表達(dá)的因素，研究生物體的生理、病理過(guò)程及對(duì)外界的干擾因素發(fā)生反應(yīng)的機(jī)制，也稱(chēng)為功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究.

為了研究選擇性COX-2抑制劑尼美舒利抗肺癌作用的分子機(jī)理，本研究應(yīng)用了功能蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，比較了尼美舒利與對(duì)照組肺癌裸鼠移植瘤的總蛋白雙向電泳凝膠圖譜，分析鑒定結(jié)果后獲得了14個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，11個(gè)蛋白質(zhì)在尼美舒利組顯著下調(diào)，其中5個(gè)與尼美舒利抗腫瘤作用相關(guān)，它們是：Rho GTPase、alpha-globin、beta-globin、heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1 Serpin 9d；3種顯著上調(diào)，它們是tropomyosin 1（TM1）、tropomyosin 2（TM2）和Myosin light chain 1（MLC1），主要與腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移有關(guān).

原肌球蛋白（tropomyosin，TM）屬于微絲結(jié)合蛋白，具有穩(wěn)定的微絲結(jié)構(gòu)，參與微絲細(xì)胞粘附和凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程，TM合成降低可改變微絲結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、錨定非依賴(lài)性生長(zhǎng)、以及抵制接觸性抑制生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移有關(guān)的能力，導(dǎo)致細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移.在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中，癌細(xì)胞首先從腫瘤中脫離下來(lái)，這一過(guò)程與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)分不開(kāi).可見(jiàn)，TM可能參與腫瘤形成和腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程.有報(bào)道認(rèn)為T(mén)PM1和TPM2與膀胱癌有關(guān)［7］，也有研究發(fā)現(xiàn)，在非肌肉細(xì)胞中，TPM1發(fā)揮著細(xì)胞轉(zhuǎn)化抑制的作用［8］，一旦TPM1受損或缺失，將導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，其異常表達(dá)是細(xì)胞離散的分子基礎(chǔ).Yi等［9］研究表明，COX-2抑制劑NS-398作用于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞RL95-2，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示有多種蛋白質(zhì)表達(dá)，鑒定出上調(diào)的蛋白質(zhì)中有tropomyosin，證明COX-2抑制劑NS-398通過(guò)tropomyosin的高表達(dá)抑制RL95-2細(xì)胞增殖、侵襲的能力.

肌球蛋白輕鏈1（fast skeletalmuscle isoform myosin light chain l，MLC1f），MLC是eukaryotic cells細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)組成部分，它對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、移動(dòng)和生長(zhǎng)發(fā)揮著重要的作用，Zhang等［10］的研究表明MLC1f抑制了細(xì)胞周期由G1期到S期，表明了MLC1有負(fù)面調(diào)整細(xì)胞增殖的作用，本研究中MLC1f在尼美舒利組表達(dá)明顯上調(diào)，是否存在尼美舒利通過(guò)非COX-2依賴(lài)途徑上調(diào)MLC1f來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的增值還需要證實(shí).

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Rho GTP酶在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，并和腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［11-12］.Rho GTP酶是細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵分子，作為分子開(kāi)關(guān)在胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮橋梁作用.實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤中可見(jiàn)Rho GTP酶表達(dá)異常，改變細(xì)胞內(nèi)Rho GTP酶的表達(dá)水平可以直接影響腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的過(guò)程［12］.Chang等［13］研究發(fā)現(xiàn)，COX-2明顯增加HCA-7細(xì)胞的Rho GTP酶的活性水平，COX-2激活了RhoA/Rho kinases（ROCK）通路，減低上皮細(xì)胞鈣黏蛋白（E-cadherin）和α-連環(huán)蛋白（α-catenin）水平，破壞了細(xì)胞連接形式及增加細(xì)胞運(yùn)動(dòng).Takaoka等［14］研究表明，COX-2在細(xì)胞及組織內(nèi)高表達(dá)，通過(guò)上調(diào)Rho GTPases，提高了致腫瘤性，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)季侵襲.

核不均一核糖核蛋白A2/B1（hnRNP A2/B1）是一種重要的RNA連接蛋白，是細(xì)胞核內(nèi)hnRNP的基本核心成分.它在癌細(xì)胞和增殖的細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，可能是細(xì)胞癌變的原因之一［15］，hnRNP A2/B1在正常肺發(fā)育的關(guān)鍵階段過(guò)度表達(dá)，表達(dá)水平與肺癌及癌前病變類(lèi)似，其在成熟肺組織中的表達(dá)被抑制，在肺癌中的表達(dá)形式類(lèi)似于胚肺生長(zhǎng)中所見(jiàn)，這種表達(dá)形式在蛋白質(zhì)和信號(hào)分子水平是一致的，顯示hnRNP A2/B1可能是一種癌生長(zhǎng)蛋白［16］，Sueoka等［17］對(duì)新鮮非小細(xì)胞肺癌組織進(jìn)行了hnRNP A2/B1表達(dá)的研究，發(fā)現(xiàn)病變晚期組hnRNP A2/B1表達(dá)陽(yáng)性率高于病變?cè)缙诮M.也有報(bào)道表明hnRNP A2/B1表達(dá)和肺癌分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［18］.

有研究表明選擇性COX-2抑制劑通過(guò)誘導(dǎo)減少COX-2mRNA及其蛋白質(zhì)表達(dá)的方式促進(jìn)細(xì)胞凋亡［4］，而COX-2mRNA的3'-UTR區(qū)域能表達(dá)一種多聚體蛋白，這個(gè)多聚體蛋白包含HuR、TLA-1、TLAR和hnRNP［5］.尼美舒利抑制COX-2mRNA及其蛋白的表達(dá)，從而抑制hnRNPA2/B1的過(guò)量表達(dá)，抑制肺癌細(xì)胞的分化、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移.監(jiān)測(cè)肺組織中hnRNPA2/B1表達(dá)有助于非小細(xì)胞肺癌的診斷，預(yù)測(cè)預(yù)后和指導(dǎo)多學(xué)科綜合治療.

本研究結(jié)果顯示：①尼美舒利干預(yù)后裸鼠移植瘤組織中Alpha-globin、beta-globin、Serine proteinase inhibitor表達(dá)明顯下調(diào)，MLC1f表達(dá)明顯上調(diào).尼美舒利通過(guò)上訴蛋白質(zhì)經(jīng)COX-2依賴(lài)或非依賴(lài)途徑發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步明確.②尼美舒利干預(yù)后裸鼠移植瘤中TPM1、TPM2表達(dá)明顯上調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)COX-2抑制劑尼美舒利通過(guò)上調(diào)TPM1、TPM2的表達(dá)抑制肺腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移.③尼美舒利干預(yù)后裸鼠移植瘤組織中Rho GTP酶表達(dá)明顯下調(diào)，表明其明顯降低肺腺癌細(xì)胞中Rho GTP酶的活性水平，通過(guò)抑制RhoA/Rho kinases（ROCK）通路，增加上皮細(xì)胞鈣粘蛋白（E-cadherin）和α-連環(huán)蛋白（α-caatenin）水平，穩(wěn)固細(xì)胞連接形式及減少細(xì)胞運(yùn)動(dòng).④尼美舒利干預(yù)后裸鼠移植瘤組織中hnRNPA2/B1表達(dá)明顯下調(diào).COX-2mRNA的3'-UTR區(qū)域能表達(dá)一種多聚體蛋白，這個(gè)多聚體蛋白中包含RNP，選擇性COX-2抑制劑尼美舒利抑制COX-2mRNA的表達(dá)，從而抑制hnRNP A2/B1的產(chǎn)生，抑制肺癌細(xì)胞的分化、浸潤(rùn)劑轉(zhuǎn)移.⑤在下調(diào)的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)未命名蛋白質(zhì)，為我們將來(lái)的研究提供了方向.總之，通過(guò)這些蛋白質(zhì)的鑒定對(duì)于確定尼美舒利抗肺癌作用的機(jī)制具有一定指導(dǎo)意義，也為進(jìn)一步研究尼美舒利奠定了基礎(chǔ).

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Mechanism of protein expression profile in the anticancer effect of selective COX-2 inhibitors

ZHU Tian-Ji，ZHANGQing
Respiratory Medicine，Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010050，China

AIM：To study themechanism of protein expression profiling in anticancer effect of selective COX-2 inhibitor nimesulide by researching nimesulide's effect on protein expression in lung cancer with the assistance of two-dimensional gel electrophoresis，mass spectrometry and bioinformatics techniques，and by separating and identifying relative proteins.M ETHODS：Nude mice models with lung adenocarcinoma A549 xenografted tumor were established and interrupted with nimesulide.Total protein of mice in the nimesulide group and control group were separated by two-dimentional gel electrophoresis.Differential protein spotswere analyzed by PDQUEST7.2，and mass spectrum was identified. RESULTS：By two-dimentional gel electrophoresis-image analysis-mass-spectrometric technique，14 differential protein spots were indentified.Among them，11 decreased in nimesulide group and 3 increased in the control group remarkably.CONCLUSION：The deferentially expressed proteins identified by mass spectrometer are of importance in guiding the research on anticancermechanism of nimesulide and thus can lay the foundation for further studies.

lung cancer；A549 xenografted tumor；proteomics；mass spectrometry

R734.2

A

2095-6894（2015）11-001-04

2015-10-14；接受日期：2015-10-30

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院重大項(xiàng)目（NYFY ZD 2012001）

朱天吉.碩士，副主任醫(yī)師.E-mail：zhutianji168@126.com

張 卿，E-mail：fczhangqing@126.com