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    肺癌組織中轉(zhuǎn)錄因子E2F-1的表達(dá)及意義

    2015-11-03 08:29:11戴彭辰何成詩(shī)劉一誠(chéng)王超群李慧英
    關(guān)鍵詞:結(jié)構(gòu)域免疫組化肺癌

    戴彭辰,何成詩(shī),劉一誠(chéng),王超群,李慧英

    (1成都中醫(yī)藥大學(xué),2成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,四川成都610075)

    ·基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)·

    肺癌組織中轉(zhuǎn)錄因子E2F-1的表達(dá)及意義

    戴彭辰1,何成詩(shī)2,劉一誠(chéng)1,王超群1,李慧英1

    (1成都中醫(yī)藥大學(xué),2成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,四川成都610075)

    目的:探究肺癌組織中轉(zhuǎn)錄因子E2F-1的表達(dá)及意義.方法:選取62例肺癌組織作為觀察組,10例正常組織作為對(duì)照組,采用免疫組化方法檢測(cè)各組織中E2F-1的表達(dá)情況.結(jié)果:E2F-1在觀察組中的陽(yáng)性表達(dá)率為67.74%,高于對(duì)照組的10.00%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且E2F-1的表達(dá)隨著腫瘤分期的升高而增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).結(jié)論:肺癌組織中E2F-1的高表達(dá)可作為腫瘤浸潤(rùn)程度的標(biāo)記物,對(duì)肺癌的發(fā)生發(fā)展起著重要作用.

    E2F-1;肺癌;免疫組織化學(xué)

    0 引言

    肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤,是目前發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快,對(duì)人民群眾健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一,其中男性肺癌發(fā)病率和死亡率均占所有惡性腫瘤的第一位,女性發(fā)病率占第二位,死亡率占第二位[1].肺癌的病因至今尚不完全明確,轉(zhuǎn)錄因子E2F-1是由人類E2F-1基因編碼出的蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)是E2F轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員.E2F家族在控制細(xì)胞周期及抑癌基因功能上起到重要作用,也是小DNA致癌病毒轉(zhuǎn)化蛋白的靶點(diǎn).研究表明,腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)錄因子E2F-1的異常調(diào)控有著密切聯(lián)系[2-3],但目前在肺癌發(fā)病機(jī)制的研究中對(duì)E2F-1的作用了解較少.本研究采用免疫組化法,檢測(cè)肺癌組織及正常組織中E2F-1的表達(dá),探討其臨床表達(dá)意義,現(xiàn)報(bào)道如下.

    1 材料和方法

    1.1組織材料 收集保存的62例肺癌組織石蠟包埋標(biāo)本,其中男32例,女30例,年齡27~69(平均55.1±3.4)歲.其中,標(biāo)本顯示腺癌20例、鱗癌28例、未分化癌14例.另選取10例癌旁正常肺組織作為對(duì)照組.兩組材料的一般情況比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性.

    1.2免疫組化方法 采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)(SP)法:①石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水.②3%H2O2去離子水(無(wú)色液體)孵育10~30 min,以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性.③蒸餾水沖洗,PBS浸泡5 min.④候選步驟:采用抗原修復(fù):微波(建議30 min內(nèi)4次中火)、高壓、酶修復(fù)方法.⑤血清封閉:室溫15~30 min.⑥滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗,37℃孵育2~3 h或4℃過(guò)夜.PBS沖洗,3 min×5次.⑦滴加生物素標(biāo)記的二抗,室溫或37℃孵育30 min~1 h.⑧PBS沖洗,3 min×5次.⑨滴加SP(鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶),室溫或37℃孵育30 min~1 h.⑩PBS沖洗,3min×5次.〇11 DAB顯色劑顯色.〇12自來(lái)水充分沖洗.〇13可進(jìn)行復(fù)染,脫水、透明.〇14選擇適當(dāng)?shù)姆馄瑒┓馄?E2F-1(1B100,抗原修復(fù))為鼠抗單克隆抗體,上海勝隆公司產(chǎn)品,PBS替代一抗陰性對(duì)照.

    1.3結(jié)果判斷 E2F-1染色后,根據(jù)染色范圍及染色程度進(jìn)行綜合判斷,分為陰性(-)和陽(yáng)性(+)2個(gè)等級(jí).陽(yáng)性表達(dá)的標(biāo)志:細(xì)胞核及胞質(zhì)中呈現(xiàn)黃褐色或黃色顆粒樣變(圖1、圖2).

    圖1 免疫組化SP法染色,細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)

    圖2 免疫組化SP法染色,細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)

    1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)數(shù)資料用%表示,行χ2檢驗(yàn),P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

    2 結(jié)果

    E2F-1在對(duì)照組中的陽(yáng)性表達(dá)率為10.00%(1/ 10),而在肺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為67.74%(42/ 62),E2F-1在肺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于對(duì)照組. E2F-1在肺癌組織中的表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理特征存在密切聯(lián)系.統(tǒng)計(jì)顯示,腫瘤的分期越晚,E2F-1的陽(yáng)性表達(dá)率越高,其中T1期表達(dá)最低,T2期及T3期表達(dá)越高,且不同分期之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);E2F-1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者體內(nèi)也出現(xiàn)了比無(wú)轉(zhuǎn)移者的高表達(dá)率,但兩者對(duì)比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);E2F-1的表達(dá)在病理結(jié)果顯示,其在鱗癌、腺癌、未分化癌中陽(yáng)性表達(dá)率依次增高,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表1).

    表1 肺癌E2F-1表達(dá)與病理特征關(guān)系(%)

    3 討論

    E2F是1986年發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期調(diào)控因子,它作為轉(zhuǎn)錄因子在cyclin-cdk-Rb通道中被激活.目前研究[4-6]顯示,E2F家族中的多個(gè)成員蛋白包含許多進(jìn)化保守的結(jié)構(gòu)域,這些結(jié)構(gòu)域包括:DNA結(jié)合域、與受分化調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子蛋白(DP)之間相互作用的二聚化結(jié)構(gòu)域、富含酸性氨基酸的轉(zhuǎn)活化結(jié)構(gòu)域以及位于轉(zhuǎn)活化結(jié)構(gòu)域中的抑癌蛋白關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域.該蛋白與其他兩個(gè)成員E2F-2及E2F-3具有額外的周期蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域,E2F-1以細(xì)胞周期依賴性的模式優(yōu)先與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白pRB結(jié)合,并可以同時(shí)介導(dǎo)細(xì)胞增殖及p53-依賴/非依賴的細(xì)胞凋亡.

    E2F異二聚體結(jié)合pRb時(shí),E2F的轉(zhuǎn)錄激活就會(huì)被抑制.E2F的釋放一般發(fā)生在G1中后期,并影響G1PS期所需的蛋白表達(dá)及DNA合成,pRb去磷酸化同時(shí)被cy-clin EPcdk2和cyclin DPcdk4P6所催化,從而影響細(xì)胞的周期運(yùn)行,因此E2F被認(rèn)為是能夠調(diào)控細(xì)胞增殖并影響細(xì)胞周期的重要轉(zhuǎn)錄因子[7-8].研究[9]還顯示,E2F的異常高表達(dá)與一些腫瘤的形成和發(fā)展存在密切聯(lián)系,并在一定程度上能夠引起細(xì)胞的過(guò)度增殖和惡性轉(zhuǎn)化.

    相關(guān)研究[10]指出,E2F-1是E2F蛋白家族中最先被克隆的轉(zhuǎn)錄因子,其特性也是整個(gè)E2F家族中最先被了解的.研究[11]還指出,E2F-1在腫瘤的發(fā)生中起到了重要作用.在多種癌癥中,均發(fā)現(xiàn)了高表達(dá)的E2F-1,這表明轉(zhuǎn)錄因子E2F-1在機(jī)體內(nèi)起到促癌基因的效果,對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著關(guān)鍵作用.Ray等[12]在Rb1(+P-)鼠的實(shí)驗(yàn)研究中指出,去除E2F-1的表達(dá)后,小鼠的甲狀腺腫瘤及垂體腫瘤的發(fā)生率顯著降低.體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)[13]證實(shí),成纖維細(xì)胞的惡性變與E2F-1的高表達(dá)有關(guān).但也有研究[14]指出,E2F-1作為轉(zhuǎn)錄因子起抑癌作用,出現(xiàn)促癌的原因可能與實(shí)驗(yàn)方法或者組織、細(xì)胞類型不同有關(guān).有研究發(fā)現(xiàn),E2F-1在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移到肺組織中表達(dá)水平明顯高于結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移到肝組織的表達(dá)水平[15].在惡性支氣管上皮細(xì)胞株的培育中,惡性支氣管上皮細(xì)胞株中E2F-1表達(dá)高于正常細(xì)胞株[16].而E2F-1是否在原發(fā)性肺癌組織中高表達(dá)的研究報(bào)道卻很少見(jiàn).

    本研究結(jié)果顯示,E2F-1在肺癌組織中表達(dá)比正常的肺組織顯著增高,說(shuō)明在細(xì)胞周期中,E2F-1的高表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞增殖、縮短細(xì)胞周期,對(duì)肺癌的發(fā)生發(fā)展有促進(jìn)作用.也有專家[17]指出,E2F-1的激活引起下游抑癌基因p73發(fā)生突變,進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡障礙,這是導(dǎo)致肺癌發(fā)生的原因之一.另外,本研究還發(fā)現(xiàn),肺癌病理類型的不同也與E2F-1的表達(dá)有關(guān),鱗癌中E2F-1的陽(yáng)性表達(dá)率為55.00%,腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)到了67.86%,而在未分化癌中其陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)80.00%,這說(shuō)明E2F-1在肺癌、腺癌及未分化癌中具有高表達(dá)率,提示可以在以后的基因靶向治療中成為一個(gè)突破口.研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄因子E2F-1的高表達(dá)還跟腫瘤的生物學(xué)行為存在關(guān)系.謝慶祥等[10]研究指出,E2F-1的表達(dá)高低和膀胱癌的分級(jí)及分期有密切聯(lián)系.研究[18]還發(fā)現(xiàn),E2F-1的高表達(dá)直接影響乳腺癌的預(yù)后,高表達(dá)的E2F-1基因在頭頸部癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄后,腫瘤浸潤(rùn)性顯著增強(qiáng).

    本研究還發(fā)現(xiàn),E2F-1的陽(yáng)性表達(dá)率隨著腫瘤分期的提高而增高,表明E2F-1的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤分期存在顯著相關(guān)性.研究結(jié)果還顯示,E2F-1的陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在一定聯(lián)系,但統(tǒng)計(jì)學(xué)意義不顯著,這表明E2F-1在腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中不能作為標(biāo)記物,也有可能與本次實(shí)驗(yàn)的方法及材料有關(guān).

    [1]Pickering MT,Stadler BM,Kowalik TF.miR-17 and miR-20a temper an E2F1-induced G1 checkpoint to regulate cell cycle progression[J].Oncogene,2009,28(1):140-145.

    [2]Ladu S,Calvisi DF,Conner EA,et al.E2F1 inhibits c-Myc-driven apoptosis via PIK3CA/Akt/mTOR and COX-2 in a mouse model of human liver cancer[J].Gastroenterology,2008,135(4):1322-1332.

    [3]Johnson DG,Schwarz JK,CressWD,et al.Expression of transcription factor E2F1 induces quiescent cells to enter S phase[J]. Nature,1993,365(6444):349-352.

    [4]Knoll S,Emmrich S,Pützer BM.The E2F1-miRNA cancer progression network[J].Adv Exp Med Biol,2013,774:135-147.

    [5]van Oosterwijk JG,Herpers B,Meijer D,etal.Restoration of chemosensitivity for doxorubicin and cisplatin in chondrosarcoma in vitro:BCL-2 family members cause chemoresistance[J].Ann Oncol,2012,23(6):1617-1626.

    [6]Xie Y,Yin Y,Li L,et al.Short interfering RNA directed against the E2F-1 gene suppressing gastric cancer progression in vitro[J]. Oncol Rep,2009,21(5):1345-1353.

    [7]Yamasaki L,Bronson R,Williams BO,etal.Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of RbI(+/-)mice[J]. Nat Genet,1998,18(4):360-364.

    [8]Hong X,Yang ZY,Wang M,et al.Multidrug resistance-associated protein 3 and Bcl-2 contribute tomultidrug resistance by vinorelbine in lung adenocarcinoma[J].Int JMol Med,2011,28(6):953-960.

    [9]Rajagopala SV,Sikorski P,Caufield JH,et al.Studying protein complexes by the yeast two-hybrid system[J].Methods,2012,58(4):392-399.

    [10]謝慶祥,張閩峰,林福地,等.膀胱癌中轉(zhuǎn)錄因子E2F的表達(dá)及其臨床意義[J].診斷病理學(xué)雜志,2002,9(2):102-103.

    [11]馮麗艷,楊生永,安國(guó)順,等.E2F-1介導(dǎo)8-氯-腺苷引起的人肺癌細(xì)胞H1299的凋亡[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2008,24(9):861-865.

    [12]Ray RM,Bhattacharya S,Johnson LR.Mdm2 inhibition induces apoptosis in p53 deficient human colon cancer cells by activating p73-and E2F1-mediated expression of PUMA and Siva-1[J].Apoptosis,2011,16(1):35-44.

    [13]Mei Y,Wu M.Multifaceted functionsof Siva-1:more than an Indian God of Destruction[J].Protein Cell,2012,3(2):117-122.

    [14]Yu B,Sun X,Shen HY,et al.Expression of the apoptosis-related genes BCL-2 and BAD in human breast carcinoma and their associated relationship with chemosensitivity[J].J Exp Clin Cancer Res,2010,29:107.

    [15]王曉通,李 雷,肖 強(qiáng),等.E2F-1過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[J].廣東醫(yī)學(xué),2009,30(11):1600-1603.

    [16]Hallstrom TC,Mori S,Nevins JR.An E2F1-dependent gene expression program that determines the balance between proliferation and cell death[J].Cancer Cell,2008,13(1):11-22.

    [17]肖 強(qiáng),徐君毅,謝玉波.E2F-1在胃癌組織中的突變表達(dá)及其意義[J].中國(guó)腫瘤臨床,2007,34(4):238-239.

    [18]Yang SZ,Lin FT,Lin WC.MCPH1/BRIT1 cooperateswith E2F1 in the activation of checkpoint,DNA repair and apoptosis[J].EMBO Rep,2008,9(9):907-915.

    Expression and significance of transcription factor E2F-1 in lung cancer tissues

    DAIPeng-Chen1,HE Cheng-Shi2,LIU Yi-Cheng1,WANG Chao-Qun1,LIHui-Ying11Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,2Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610075,China

    AIM:To investigate the expression and significance of transcription factor E2F-1 in the pathogenesis of lung cancer. METHODS:A total of 62 cases of lung cancer were selected as the observation group and 10 cases of normal tissue as the control group.The expression of E2F-1 was detected by immunohistochemicalmethod.RESULTS:The rate of positive expression of E2F-1 in observation group was 67.74%,which was higher than 10.00%in the control group,and the difference was statistically significant(P<0.05).The expression of E2F-1 increased with tumor staging increasing,and the difference was statistically significant(P<0.05).CONCLUSION:The high expression of E2F-1 can be used as amarker of tumor invasion in lung cancer tissues,which plays an important role in the development of lung cancer.

    E2F-1;lung cancer;immunohistochemistry

    R734.2

    A

    2095-6894(2015)12-01-03

    2015-10-27;接受日期:2015-11-13

    戴彭辰.博士,主治醫(yī)師.研究方向:肺癌.

    E-mail:hzdpc1977@163.com

    何成詩(shī).碩士,主任醫(yī)師,教授.研究方向:呼吸內(nèi)科.

    E-mail:18980880131@126.com

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