不同抑制劑脫除方法對玉米秸稈水解液發(fā)酵的影響

楊 敏， 田 磊， 張培玉*， 李小琳

（青島大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266071）

化石燃料的枯竭和全球變暖正在把人們的視野轉(zhuǎn)向生物燃料的研究，丁醇是產(chǎn)醇梭菌的代謝產(chǎn)物（Acetone，Butanol，Ethanol，ABE）之一，與乙醇相比，具有高燃值，與汽油混合使用，不易腐蝕管道，便于運輸?shù)葍?yōu)點。傳統(tǒng)的丁醇發(fā)酵用的原料來源于糧食，既推高了丁醇價格，又造成了與人爭糧的境況。農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物，如麥麩、秸稈、稻草等木質(zhì)纖維素，以其分布廣泛，簡便易得的特點，成為近年來研究熱點。木質(zhì)纖維素類材料一般需經(jīng)過預(yù)處理和纖維素酶的水解方能被產(chǎn)醇梭菌所利用，但眾所周知，在高溫、低pH的預(yù)處理過程中，一些發(fā)酵抑制劑隨著產(chǎn)生，包括呋喃醛（糠醛和5-羥甲基糠醛（HMF））、脂族羧酸（如乙酸、甲酸和乙酰丙酸）以及酚類化合物[1]。因此，在微生物發(fā)酵之前，必須要去除發(fā)酵液中存在的抑制劑。

許多物理、化學(xué)和生物的方法被應(yīng)用于木質(zhì)纖維素類水解液中抑制劑的去除，可概括為以下幾種[2-4]：加堿（NaOH，Ca(OH)2和NH4OH），離子交換樹脂，加還原性物質(zhì)（如亞硫酸鈉，連二亞硫酸鈉），加活性炭，酶處理（漆酶和過氧化物酶）。出于工業(yè)應(yīng)用考慮，所采用的方法必須要高效廉價，且不能與發(fā)酵過程中其它步驟相沖突。國內(nèi)外近年來對于抑制劑脫除的研究相當(dāng)活躍，Dae Haeng Cho[5]利用過氧化氫的氧化能力，通過向水解液中投加0.01 mM的過氧化氫，即可100%的去除所有的抑制劑，丁醇的產(chǎn)量顯著得到提高。Larsson[6]通過向產(chǎn)乙醇的酵母Saccharomyces cerevisiae體內(nèi)導(dǎo)入編碼漆酶的基因片段，獲得突變株，漆酶的過量表達使新的菌株對酚醛具有很好的抗性。

本實驗利用活性炭、Ca(OH)2、活性炭＋Ca(OH)2、亞硫酸鈉和連二亞硫酸鈉對玉米水解液進行抑制劑的脫除，探究了不同處理方法對水解液中各組分（糖、抑制劑）及對發(fā)酵的影響，通過實驗比較確定兩株產(chǎn)醇梭菌發(fā)酵玉米秸稈水解液能力，利用耐抑制劑較好的Clostridium beijerincii 8052發(fā)酵脫除抑制劑后水解液，檢測幾種脫毒方法對發(fā)酵的影響。

1 實驗

1.1 材料

玉米秸稈氣爆預(yù)處理物主要成分為：水60%，纖維素16%，半纖維素10%，木質(zhì)素及其它14%。

實驗測得纖維素酶最適溫度50℃，最適pH 4.8，濾紙酶活為39.60±1.52 U[7]。

拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii NCIMB 8052），購自英國國家工業(yè)、海洋和食品菌種保藏中心。丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum 824），購自美國菌種保藏中心。

普通培養(yǎng)基（P2）：葡萄糖70 g/L，酵母粉1 g/L，K2HPO40.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，CH3COONH42.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·H2O 0.01 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g/L，NaCl 0.01 g/L，對氨基苯甲酸 0.001 g/L，維生素B1 0.001 g/L，生物素 0.000 1 g/L，115℃下滅菌20 min。水解液發(fā)酵培養(yǎng)基：將普通發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖置換為秸稈水解液，總糖濃度為70 g/L左右。

1.2 秸稈預(yù)處理物的酶解方法

配制不同固液比（m/V）的氣爆秸稈150 mL酶解體系，用5 M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至4.8，121 ℃下滅菌20 min，冷卻至室溫后，加入纖維素酶1.45 mL（0.05 mL/g干重），于110 r/min，50 ℃搖床中水解72～96 h，后將得到的水解液在4 000 r/min下離心分離15 min。

1.3 抑制劑脫除方法

Ca(OH)2法：用Ca(OH)2固體粉末調(diào)節(jié)水解液pH至11，于30 ℃，110 r/min搖床反應(yīng)1 h。

活性炭法：向水解液中加入7.5%活性炭，于30 ℃，110 r/min搖床12 h。

Ca(OH)2＋活性炭法：先用Ca(OH)2固體粉末調(diào)節(jié)水解液pH至11，后加入7.5%活性炭，于30℃，110 r/min搖床12 h。

亞硫酸鈉法和連二亞硫酸鈉法：向水解液中分別加入兩種物質(zhì)，使兩種物質(zhì)終濃度為10 mM，于30℃，110 r/min搖床12 h[1]。

1.4 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：15 mL厭氧管，培養(yǎng)基5 mL，接種孢子懸液量2%，70℃熱激10 min，37℃厭氧恒溫培養(yǎng)12～16 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：250 mL厭氧瓶，裝液量50 mL，接種量5%，37℃厭氧恒溫培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞濃度測定

細(xì)胞濃度通過測量樣品在可見光分光光度計600 nm波長條件吸光度值，同時以離心上清液做對照，吸光度值大于0.8即稀釋。

1.6 水解液中抑制劑濃度的測定

取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL EP 管中，12 000 r/min 離心5 min，得到的上清液以0.22 mm濾膜過濾進行液相色譜檢測。檢測方法：蒸發(fā)法光＋紫外，色譜柱：Agilent SB-C 18，流動相：甲醇/水＝0.2∶0.8，柱溫：35℃。

1.7 可溶性木素的檢測方法[8-9]

按公式（1）、（2）計算可溶性木素含量：

式中，SL為可溶性木素含量；ALIG280為水解液在280 nm下的吸光度；CF為糠醛體積濃度（g/L）；CHMF為 HMF 體積濃度（g/L）；eF＝146.85；eHMF＝114。

1.8 溶劑產(chǎn)量測定方法

取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL EP 管中，12 000 r/min 離心5 min，得到的上清液轉(zhuǎn)到新的1.5 mL EP 管中，用萃取劑（以乙酸乙酯為溶劑配制的5 g/L 異戊醇）萃取，上下翻轉(zhuǎn)15次，取上層液體采用氣相色譜法進行檢測。色譜柱：InterCap WAX，柱長30 m×0.25 mm；檢測器: FID；色譜條件：初始溫度為35 ℃，第1次程序升溫2℃/min至45℃；第2次程序升溫40℃/min至150℃，維持1 min。注射器溫度為280℃，載氣為氮氣，檢測器溫度為300℃，內(nèi)標(biāo)物為異戊醇[10]。

1.9 發(fā)酵液糖含量測定

采用DNS法測定發(fā)酵液中糖含量[11]。

2 結(jié)果與討論

2.1 活性炭、Ca(OH)2及兩種還原性物質(zhì)對玉米秸稈水解液中各抑制劑的影響

一般說來，在確定抑制劑的脫除方法之前，需要先弄清水解液中主要抑制劑的成分，脫毒的方法必須簡單高效，價格低廉，能夠?qū)Ｒ坏娜コ庖褐械囊种苿＝?jīng)液相色譜檢測，在玉米秸稈水解液中，存在的主要抑制劑成分為糠醛、羥甲基糠醛以及一些無法檢測出具體成分的可溶性木素（如圖 1所示）。通過查看相關(guān)文獻[12-15]，發(fā)現(xiàn)活性炭吸附和Ca(OH)2以及一些還原性物質(zhì)被廣泛用于木質(zhì)纖維素類水解液的抑制劑脫除。

圖1 抑制劑脫除前后水解液成分的檢測

如表1所示，五種不同的脫毒方式被用于玉米秸稈水解液中抑制劑的脫除，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在活性炭存在情況下，水解液中還原糖濃度下降明顯，活性炭、活性炭＋Ca(OH)2分別造成了 17.7%和 28.9%的糖損失，Ca(OH)2單獨作用時只造成9.7%的糖損失。而相反的，Guo等[1]的實驗發(fā)現(xiàn)Ca(OH)2脫毒對糖造成的損失比活性炭要大，這與Ca(OH)2、活性炭的添加量，以及后期的除去這兩種物質(zhì)的方式有關(guān)。在抑制劑的去除方面，有活性炭參與的脫毒效果最明顯，活性炭＋Ca(OH)2兩者共同作用起到了很好的協(xié)同作用，抑制劑的去除率最高，糠醛（98.95%），HMF（99.6%），SL（77%），這比以前的一些結(jié)果略高[16]；活性炭單獨吸附次之，糠醛（97.1%），HMF（96.4%），SL（72.5%）；Ca(OH)2脫除效率最后，糠醛（35.3%），HMF（26.9%），其中可溶性木素的含量沒降低反而增加?？扇苄阅舅厥且活惐江h(huán)數(shù)不定的有機化合物的總稱，在酸解氣爆的過程中，從木質(zhì)素上脫落，Ca(OH)2的加入導(dǎo)致其含量的增加，是由于堿的加入使得木質(zhì)素結(jié)構(gòu)變得松散不穩(wěn)定，原本的一些木素脫落溶解于水解液。與氣爆秸稈水洗液相比，在酶解的過程中會有部分的糠醛和羥甲基糠醛產(chǎn)生，可溶性木素的量基本保持不變，Palmqvist和Hagerdal[16]的研究結(jié)果解釋了這一現(xiàn)象，他們認(rèn)為在一定溫度和壓力下，水解液中產(chǎn)生的葡萄糖和木糖會被分別降解為糠醛和羥甲基糠醛。亞硫酸鈉和連二亞硫酸鈉對水解液中還原糖以及抑制劑濃度均無太大影響，這與 Alriksson等[17]人的研究結(jié)果一致。

表1 添加物對水解液中各組分的影響

2.2 兩種產(chǎn)溶劑梭菌發(fā)酵水解液的比較

工業(yè)上用于生物丁醇生產(chǎn)的菌株主要有兩種，即拜氏梭菌和丙酮丁醇梭菌。對于以木質(zhì)纖維素水解液為底物的厭氧發(fā)酵，文獻中使用較多的為拜氏梭菌，但不同菌對于不同水解液、不同抑制劑的耐受度不一樣，比如Alriksson和Cavka[18]就發(fā)現(xiàn)，在云杉水解液中，產(chǎn)乙醇酵母S. cerevisiae比產(chǎn)細(xì)菌纖維素菌G. xylinus更能耐受抑制劑。因此，通過實驗希望選出一種比較合適用于玉米秸稈水解液發(fā)酵的菌株，從而來檢驗不同抑制劑脫除方法的效果。以酶解后未脫毒的水解液為底物，Clostridium beijerincii 8052和 Clostridium acetobutylicum 824分別發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)兩株菌的生長均受到抑制，其中Clostridium acetobutylicum 824細(xì)胞生長量很少，溶劑產(chǎn)量基本沒有，生長完全被抑制。Clostridium beijerincii 8052細(xì)胞生長量明顯較多，最高OD600nm達到2.3左右，溶劑產(chǎn)量分別為丁醇0.15 g/L、丙酮0.34 g/L、乙醇0.112 g/L。由此可見，在玉米秸稈水解液中，拜氏梭菌具有更高的抑制劑耐受濃度，更高的環(huán)境適應(yīng)性，比較合適用于后續(xù)的實驗。

2.3 Clostridium beijerincii 8052發(fā)酵不同抑制劑脫除方法的水解液比較

將脫毒后水解液pH調(diào)到6～6.5左右，補加各類營養(yǎng)元素，向每瓶培養(yǎng)基中接種5%種子液，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

圖2為不同抑制劑脫除方法對發(fā)酵過程的影響。由圖2可知，從細(xì)胞量上看，活性炭單獨處理最高，Ca(OH)2處理次之，活性炭＋Ca(OH)2共處理最低。從溶劑（ABE）總產(chǎn)量上看，經(jīng) Ca(OH)2和活性炭單獨處理的水解液中，ABE濃度接近，約為14.4 g/L，經(jīng)Ca(OH)2和活性炭聯(lián)合處理的水解液中，溶劑濃度為12.32 g/L，低14.5%。而抑制劑脫除率為：活性炭＋Ca(OH)2＞活性炭＞Ca(OH)2，這其中產(chǎn)生了一些矛盾。活性炭和Ca(OH)2共處理產(chǎn)生的并不是簡單的疊加效應(yīng)，二者相互影響。Fox等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在高pH條件下，活性炭對于水解液中一些未知組分，如酚類化合物，吸附能力與pH較低時相比明顯降低，這些未知化合物對微生物生長的毒害更大。在實驗中，活性炭和Ca(OH)2共處理是先通過Ca(OH)2固體先調(diào)節(jié)水解液pH至11，后加入活性炭，這就解釋了共處理條件下溶劑產(chǎn)量不高。

圖2 不同抑制劑脫除方法對發(fā)酵過程的影響

從丁醇、丙酮和乙醇的產(chǎn)量變化上來看，Clostridium beijerincii 8052發(fā)酵Ca(OH)2處理過的水解液需要經(jīng)過24 h的適應(yīng)期，因為其水解液中還存在較高的抑制劑濃度。適應(yīng)期后，溶劑產(chǎn)率迅速增加，這一點從24 h到60 h期間的丁醇產(chǎn)率就可看出?；钚蕴浚獵a(OH)2、活性炭、Ca(OH)2丁醇產(chǎn)率分別為0.137g/L·h、0.177 g/L·h、0.216 g/L·h。48 h后，Ca(OH)2處理過的水解液中溶劑濃度超過活性炭＋Ca(OH)2共處理，50 h左右，產(chǎn)量即和活性炭處理的水解液相當(dāng)。

3 總結(jié)

本文利用活性炭、Ca(OH)2、活性炭＋Ca(OH)2、亞硫酸鈉和連二亞硫酸鈉對玉米水解液進行抑制劑的脫除，探究了不同處理方法對水解液中各組分（糖、抑制劑）及對發(fā)酵的影響，取得以下結(jié)果：

1）對水解液中糠醛、HMF、可溶性木素三種主要抑制劑，抑制劑脫除率由高到底依次為：活性炭＋Ca(OH)2＞活性炭＞Ca(OH)2＞亞硫酸鈉和連二亞硫酸鈉，其中兩種還原性物質(zhì)亞硫酸鈉和連二亞硫酸鈉基本不起作用，這與對水解中還原糖造成的損失相一致。

2）抑制劑未脫除的玉米秸稈水解液，分別用 Clostridium beijerincii 8052和Clostridium acetobutylicum 824發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)Clostridium acetobutylicum 824生長完全受到抑制，而Clostridium beijerincii 8052則表現(xiàn)出一定的生長和產(chǎn)溶劑能力。

3）上述脫除方法對Clostridium beijerincii 8052發(fā)酵水解液的影響，由好到差依次為：Ca(OH)2＞活性炭＞活性炭＋Ca(OH)2＞亞硫酸鈉和連二亞硫酸鈉，活性炭＋Ca(OH)2的組合雖能最大程度去除抑制劑，但同時也對微生物發(fā)酵造成一定負(fù)面影響。

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