PPARG基因taqSNPs遺傳模型及單體型與2型糖尿病的相關(guān)性?

多力坤買買提玉素甫，祖克拉肉孜，宋曼殳，趙飛飛，伊力哈木乃扎木

(1.新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.首都醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生與家庭醫(yī)學(xué)學(xué)院，北京 100069)

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，2型糖尿玻 T2DM）的發(fā)病率有了顯著的增加.目前，通過關(guān)聯(lián)研究，己有數(shù)百個T2DM的候選基因被報道，其中包括與胰島B細胞功能缺陷、胰島素抵抗及肥胖有關(guān)的基因，還包括一些與T2DM并發(fā)癥相關(guān)的基因[1?4].國外有研究發(fā)現(xiàn)peroxisome proliferators-activated receptor gamma（PPARG）基因及其編碼的蛋白質(zhì)PPARG與2型糖尿病的相關(guān)性[5].PPARG是屬于轉(zhuǎn)錄因子的核激素受體超家族成員，參與糖脂代謝和線粒體能量代謝調(diào)節(jié)，推測可能與糖尿病的發(fā)生有關(guān).這些發(fā)現(xiàn)提示PPARG基因與2型糖尿病、代謝綜合征及脂類糖類代謝密切相關(guān)[5?8].本研究的目的就是應(yīng)用遺傳模型及單體型對照病例的研究方法探討PPARG基因與2型糖尿病的關(guān)系.

1 對象與方法

1.1 研究對象

在新疆阿圖什市哈拉峻鄉(xiāng)人民醫(yī)院協(xié)助下采集無血緣關(guān)系的柯爾克孜族血樣117例，同時用統(tǒng)一調(diào)查表進行直接問卷調(diào)查進行資料收集.采用病例一對照研究，篩選無血緣關(guān)系、年齡性別匹配的柯爾克孜族受試者100例，其中50例患者組與50例對照組，對所有的受試者進行了身高、體重、腰圍、臀圍、血壓、空腹血糖、血脂水平包括甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)的檢測.要求所有調(diào)查對象均在所在地區(qū)居住三代以上，無血緣關(guān)系，年齡>40歲，家庭婚姻史為世代族內(nèi)通婚.自肘靜脈采血5ml加EDTA二鉀抗凝，充分混勻后分離血漿，放入-20?C冰箱冷藏室保存待檢生化指標和基因組DNA.

本研究所使用的所有研究對象均從阿圖什市哈拉峻鄉(xiāng)人民醫(yī)院提供的居民健康檔案庫資料中篩選，在該醫(yī)院醫(yī)護人員協(xié)助下采集完成.2型糖尿病新診斷標準遵循世界衛(wèi)生組織診斷標準[9].對照組均無代謝性疾病背景.對調(diào)查對象進行詳細詢問按項目內(nèi)容逐項填寫，力求調(diào)查表完整不缺項：電話、年齡、性別、身高、體重、腰圍、臀圍、血壓、心率、吸煙史、飲酒史、家族史等.上述調(diào)查和取樣均征得受試者本人同意并簽署知情同意書.

1.2 方法

（1）基因組DNA的提取及DNA樣品濃度和純度質(zhì)檢：采用Transgenic Biotech有限公司的EasyPureTMBlood Genomic DNA Kit試劑盒.分離出的DNA用瓊脂糖凝膠電泳法檢驗，并通過紫外分光光度計檢測OD260/OD280數(shù)值，調(diào)整DNA終濃度在30-50 ng/μl之間.

（2）PCR與基因分型分析：根據(jù)SNP位點利用Assay Design 3.1軟件設(shè)計PCR引物和單堿基延伸引物.本項分析是由毅新興業(yè)（北京）科技有限公司（Bioyong Technologies Inc.）利用美國Sequenom公司的Mass ARRAY系統(tǒng)完成，該系統(tǒng)是基于基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF-MS）.首先所延伸引物通過質(zhì)譜預(yù)實驗進行質(zhì)檢，將引物稀釋到質(zhì)譜反應(yīng)所需濃度，PCR引物儲備液制備終濃度為100 p（u mol/L），單堿基延伸引物儲備液終濃度為500 p（u mol/L）.Mass ARRAY系統(tǒng)具體步棸如下：5μl的PCR反應(yīng)體系中含有ddH2O 1.8μl，10×buffer0.5μl，Mg2+0.4μl，dNTP 0.1μl，Hot star 0.2μl，F(xiàn) Primer/R Primer各0.5μl，所有需要分型的基因組DNA樣品（20 ng-50 ng）1μl，至終體積5μl.PCR擴增反應(yīng)條件：95?C 2min 預(yù)變性，95?C 30s，56?C 30s，72?C 60 s，45個循環(huán)，最后72?C 5 min，25?C∞.PCR擴增后，剩余的dNTP將被去磷酸化消化掉，用總體積2×460μl的SAP酶Mix反應(yīng)體系包括dddH2O 1.53×460μl，SAP Buffer 0.17×460μl，SAP Enzyme0.3×460μl.該反應(yīng)在PCR儀中按照下述程序進行SAP酶消化：37?C40 min，85?C5 min，最后25?C∞.SAP酶消化后，單堿基延伸反應(yīng)在下列反應(yīng)體系中進行，單堿基延伸反應(yīng)Mix反應(yīng)體系含有三蒸水0.619×460μl，10×iplex buffer0.2×460μl，Terminator mix0.2×460μl，引物0.94×460μl，單堿基延伸酶0.041×460μl，至終體積2×460μl.單堿基延伸反應(yīng)在下列條件下進行：預(yù)變性94?C 30s，然后94?C 5s，52?C 5s，80?C 5s，共40個循環(huán)，最后72?C 3min，25?C∞.將反應(yīng)產(chǎn)物的384孔板中加入16μl三蒸水，2000轉(zhuǎn)離心3 min；加入樹脂，在反轉(zhuǎn)搖勻儀上做樹脂純化反應(yīng)35 min，脫鹽，反應(yīng)完成后2000轉(zhuǎn)離心3 min.將脫鹽處理后的樣品點在樣品靶上，自然結(jié)晶，并用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜進行分析.最終結(jié)果由Mass ARRAY-軟件系統(tǒng)實時讀取，并Mass ARRAY Typer 4.0軟件檢測質(zhì)譜峰，并根據(jù)質(zhì)譜峰圖判讀各樣本目標位點基因型.

1.3 主要試劑和儀器

1.3.1 試劑

質(zhì)譜分析(Complete Genotyping Reagent Kit for Mass ARRAY?Compact 384；USA);提取DNA試劑（EasyPureTMBlood Genomic DNA Kit；Transgenic Biotech）.

1.3.2 儀器

基因擴增儀:（ABI Gene Amp?9700 384 Dual；USA）；質(zhì)譜點樣儀：(Mass ARRAY Nanodispenser RS1000；USA）；質(zhì)譜分析：(Mass ARRAY Compact System；USA)；臺式離心機（Pico，德國Hereaus）；移液器（0.5-10μ1、10-100μ1、100-1000μ1，德國）；微波爐（W700A，亞美公司(日本)）；凝膠成像儀（Gel Dox XR，美國Bio-Rad）；全自動高壓滅菌9SM510，日本Yamato)；電泳儀（Power Basic，美國Bio-Rad0）.

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

兩組之間均數(shù)比較用成組t檢驗，頻率比較的單因素分析采用χ2檢驗，群體基因型經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗.每個SNP與T2DM的遺傳效應(yīng)之間的相關(guān)性通過非條件Logistic回歸分析計算出優(yōu)勢比及95%的可信區(qū)間，并對年齡和BMI進行了校正.使用Haploview 4.2分析軟件進行LD分析及單體型的頻率比較.統(tǒng)計分析均以P<0.01具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 病例-對照組臨床資料

采用t檢驗比較基本臨床資料.血壓(SBP、DBP)、腰臀比值、血糖、總膽固醇、低密度脂蛋白水平在對照和病例兩組間有顯著差異(P<0.01)，見表1.

表1 兩組病例臨床資料

2.2 對照-病例組基因分型

根據(jù)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）反應(yīng)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，應(yīng)用Typer 4.0軟件檢測質(zhì)譜峰，并根據(jù)質(zhì)譜峰圖判讀各樣本目標位點基因型，見圖1.

圖1 rs1899951 Mass ARRAY等位基因分型示意圖

2.3 23個位點Hardy—Winberg平衡吻合度檢驗

PPARG基因所篩選的23個SNPs 位點借于MAF值進行Hardy—Weinberg遺傳平衡定律檢驗，除了rs9310401，rs9817428，rs17036242位點以外，其他位點均符合，具有群體代表性(P>0.05)，見表2.

表2 選擇標簽SNP基本情況

2.4 單個SNP與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)

采用Pearsonχ2檢驗的連續(xù)性校正（correction for continuity）和Fisher精確檢驗，比較各位點的等位基因，以及不同遺傳模型下基因型頻率分布在對照組和患者兩組中是否具有統(tǒng)計學(xué)差異，目的在于確定檢測的位點是否與疾病相關(guān).在共顯性遺傳模型、顯性遺傳模型和隱性遺傳模型下23個SNPs位點與2型糖尿病進行關(guān)聯(lián)分析，年齡和BMI等危險因素在對照組和病例組統(tǒng)計時予以校正.結(jié)果顯示，23個SNP位點中rs1801282，rs1899951，rs2881654，rs2921190，rs2959272，rs1875796，rs4135275，rs1151999位點在不同遺傳模型下基因型頻率分布在對照組和患者兩組中有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001，P<0.05)，其中rs1801282、rs1899951、rs2881654、rs2972162位點基因型在對照和病例組中的分布除了在隱性模型中未見顯著的統(tǒng)計學(xué)意義之外，在共顯性模型和顯性模型均存在顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，P<0.05)，rs2921190、rs2959272、rs1875796、rs1151999位點基因型在對照和病例組中的分布除了在共顯性模型和隱性模型中未見顯著的統(tǒng)計學(xué)意義之外，在顯性模型存在顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05).三種遺傳模型下各個SNP與2型糖尿病易感性的關(guān)系如表3所示.

表3 23個單個SNP位點基因型在不同遺傳模型下與T2DM的關(guān)聯(lián)

表3續(xù) 23個單個SNP位點基因型在不同遺傳模型下與T2DM的關(guān)聯(lián)

表3續(xù) 23個單個SNP位點基因型在不同遺傳模型下與T2DM的關(guān)聯(lián)

表3續(xù) 23個單個SNP位點基因型在不同遺傳模型下與T2DM的關(guān)聯(lián)

2.5 PPARG基因23個SNPs位點的連鎖不平衡分析

所用軟件:SPSS 17.0 statistical packages(SPSS,Chicago,IL)PLINK software package(version1.07)，SNP Stats web tool.(http://bioinfo.iconcologia.net/SNPstats web)和Haploview software package(version 4.2).連鎖不平衡分析(linkage disequilibrium analysis)利用參數(shù)D’,r2衡量SNP位點間的連鎖不平衡程度，采用D’置信區(qū)間法劃分單體型區(qū)塊LD Block.

用Haploview統(tǒng)計軟件進行連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)rs4684846，rs9817428，rs17036242，rs9310401，rs1801282,rs1899951，rs7615916 7個SNPs處于同一個單體型區(qū)塊中稱為單體型區(qū)塊Ⅰ（LD BlockⅠ）；rs2938397，rs2292101，rs2959273，rs4135275，rs709151，rs1175540 6個SNPs處于另一個單體型區(qū)塊中稱為單體型區(qū)塊Ⅱ（LD BlockⅡ）.當(dāng)連鎖不平衡系數(shù)（）和關(guān)聯(lián)系數(shù)（r2)都為1時，表示SNPs位點間存在強連鎖不平衡.柯爾克孜族人群23個位點中13個SNPs位點分別位于兩個單體型區(qū)塊，每個單體型區(qū)塊內(nèi)的SNP間的連鎖不平衡系數(shù)值都為1，且r2基本都大于0.33，表明該多態(tài)性位點彼此之間處于強連鎖不平衡關(guān)系，可用于單體型分析，見圖2和圖3.

圖2 PPARG基因23個SNP的連鎖不平衡結(jié)構(gòu)和單體型區(qū)塊

圖3 PPARG基因23個SNP的連鎖不平衡結(jié)構(gòu)和單體型區(qū)塊

2.6 單體型病例對照分析

利用Haploview軟件分別構(gòu)建病例組和對照組PPARG基因13個SNPs位點的單體型，以單體型頻率>0.01為準，主要有10種單體型，它們分布為兩個單體型區(qū)塊.這種較少的單體型變異也顯示PPARG基因內(nèi)的SNP連鎖不平衡較強，重組較少.

PPARG基因第一單體型區(qū)塊（單體型區(qū)塊Ⅰ）有7個SNPs（rs4684846，rs9817428，rs17036242，rs9310401，rs1801282，rs1899951，rs7615916）位點組成的4種主要的單體型(frequency>0.01)，以ACGTCGG為主，GAACCGA次之，其他單體型為GAGTCGG，GAACGA.4種單體型在對照組和病例組中的分布特征相比較，GAACGAA單體型組間具有統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=4.935,P=0.0263,P<0.05)，結(jié)果見表4.

表4 單體型區(qū)塊Ⅰ4種常見單體型在對照組和患者組的分布特征

PPARG基因第二單體型區(qū)塊(單體型區(qū)塊Ⅱ)有6個SNPs（rs2938397，rs2292101，rs2959273，rs4135275，rs709151，rs1175540）位點的組成的6個主要的單體型(frequency>0.01)，以CCCGGC為主，CCCAGC次之，其他的單體型為TCTAAA，TTTAAA，TCTAGC和TCTGGA.6種單體型在對照組和病例組中的分布特征比較，發(fā)現(xiàn)組間未具有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，結(jié)果見表5.

表5 單體型區(qū)塊Ⅱ6種常見單體型在對照組和患者組的分布特征

3 討論

人類基因組計劃為疾病的治療和預(yù)防提供了更多的有效工具，帶動了診斷與檢測產(chǎn)品及方法的研究開發(fā)，在遺傳疾玻 糖尿病、脂肪肝、代謝綜合征等）進行篩選和診斷，并根據(jù)結(jié)果進行有效治療并促進預(yù)測及預(yù)防醫(yī)學(xué)的發(fā)展有很大的幫助.目前慢性玻 糖尿病、高血壓、心臟病等）的發(fā)病頻率很高，人們急需了解如何預(yù)防此類疾玻 方法之一就是通過基因診斷與檢測了解一個人的基因型，并預(yù)計他患病的可能性，從而營造適當(dāng)?shù)耐獠凯h(huán)境，達到預(yù)防的目的，有助于實現(xiàn)個體化醫(yī)療與個體化健康[10].隨著人類基因組研究的縱深發(fā)展，對人類基因組多態(tài)性（SNP）及變異的研究十分必要，人類DNA序列變異約90%表現(xiàn)為單個核苷酸的多態(tài)性，故SNPs是一種常見的遺傳變異類型[11].

目前研究糖尿病相關(guān)基因常用的技術(shù)是基因組掃描和連鎖分析，連鎖分析適用于分析基因型與表型有較密切關(guān)系，且疾病表型較單一的致病基因.一般認為研究T2DM等多遺傳因素及環(huán)境因素參與的復(fù)雜性疾病時，采用基于群體的基因組SNP“case-control”關(guān)聯(lián)分析，特別是基于連鎖不平衡（linkage disequilibrium,LD）的關(guān)聯(lián)分析，比連鎖分析更有效[12?13].關(guān)聯(lián)分析是基于群體中無親緣關(guān)系的病例組和表現(xiàn)型正常的對照組在某個遺傳標記位點上會出現(xiàn)不同的頻率而設(shè)計的，通過兩者頻率的不同，就能推測所研究的遺傳標記和某個遺傳病易感位點之間是否存在因果關(guān)系或連鎖不平衡.通過關(guān)聯(lián)研究，己有數(shù)百個T2DM的候選基因被報道，其中包括與胰島B細胞功能缺陷、胰島素抵抗及肥胖有關(guān)的基因，還包括一些與T2DM并發(fā)癥相關(guān)的基因[14].PPARγ變異與胰島素分泌和胰島素敏感性胰島素抵抗是T2DM患者的常見特征，它可以預(yù)測糖尿病的發(fā)玻 T2DM患者骨骼肌胰島素抵抗的特征包括胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取和利用不充分及脂肪氧化抑制效應(yīng)減弱，需機體分泌較多的胰島素方能代償此種缺陷.復(fù)雜疾病關(guān)聯(lián)研究存在的最大問題是可能產(chǎn)生因群體分層(Population Stratification)導(dǎo)致的假陽性錯誤.而隔離人群人口流動性小、具有相對均一的遺傳背景，可避免群體分層問題；此外，利用隔離人群識別侯選基因所需的受試樣本量與遺傳標記數(shù)量相對較少，可為識別相關(guān)基因（如致病基因等）的研究提供易于統(tǒng)計分析的群體模型，在解析復(fù)雜性狀方面具有不容忽視的特殊價值[15].

本研究通過T2DM遺傳學(xué)研究中使用最廣泛的“病例-對照”研究方法尋找柯爾克孜族人群中T2DM的易感基因，為T2DM的早期分子診斷和干預(yù)提供初步線索[15].將為新疆地方與民族高發(fā)性疾病的預(yù)防、早期診斷和治療等提供重要理論依據(jù).研究結(jié)果提示，在對照組和2型DM組間分別在血壓(SBP、DBP)、腰臀比值、血糖、總膽固醇、低密度脂蛋白水平有顯著差異(P<0.01).單個SNP位點分析采用Pearsonχ2檢驗的連續(xù)性校正和Fisher精確檢驗方法，不同遺傳模型下PPARG基因23個SNP位點中rs1801282，rs1899951，rs2881654，rs2921190，rs2959272，rs1875796，rs4135275，rs1151999位點基因型在對照組和病例間的分布具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001,P<0.05)，其中rs1801282、rs1899951、rs2881654、rs2972162位點基因型在對照和病例組中的分布除了在隱性模型中未見顯著的統(tǒng)計學(xué)意義之外，在共顯性模型和顯性模型均存在顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，P<0.05)，rs2921190、rs2959272、rs1875796、rs1151999位點基因型在對照和病例組中的分布除了在共顯性模型和隱性模型中未見顯著的統(tǒng)計學(xué)意義之外，在顯性模型存在顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05).PPARG基因單體型區(qū)塊Ⅰ7個SNPs（rs4684846，rs9817428，rs17036242，rs9310401，rs1801282，rs1899951，rs7615916）位點組成的4個主要單體型中GAACGAA單體型在對照組和患者組間分布具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05).單體型區(qū)塊Ⅱ6個SNPs（rs2938397，rs2292101，rs2959273，rs4135275，rs709151，rs1175540）位點組成的6個主要的單體型組間分布均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05).最近Ruchat[16],Azab[17]Khadija Tariq[18],Qi PEI[19]等分別以居住在加拿大的阿拉伯人、巴基斯坦人、中國漢族人群為對象進行PPARGrs1801282多態(tài)性與T2DM關(guān)聯(lián)，也得出了相同的結(jié)論.關(guān)于新疆柯爾克孜族與3個國外種族的基因型和等位基因型頻率特征比較，結(jié)果顯示所選的SNPs中rs3856806，rs7615916，rs7626560，rs4135304，rs4135343位點在柯爾克孜族人群與CHB（北京漢族人）人群間基因型和等位基因分布頻率均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01).rs2292101，rs2959273，rs3856806，rs4684846，rs6782475，rs7615916，rs7626560，rs9817428，rs4135304，rs4135343位點在柯爾克孜族人群與CEU（歐洲北部和西部猶他州居民）人群間基因型和等位基因分布頻率均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01).在SNPs中除了rs17036242，rs7615916，rs9310401，rs9817428，rs2938397，rs2959272位點外，rs1151999，rs1175540，rs1875796，rs1899951，rs2292101，rs2881654，rs2921190，，rs2959273，rs2972162，rs3856806，rs4135247，rs4135275，rs4684846，rs6782475，rs4135343位點在柯爾克孜族人群與YRI（非洲伊巴丹尼日利亞人）人群間基因型和等位基因分布頻率均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)[20].

總之，采用病例-對照關(guān)聯(lián)分析方法，新疆柯爾克孜糖尿病病例組和對照組PPRAG基因23個SNP位點多態(tài)性特征比較研究結(jié)果顯示，共顯性模型、顯性模型和隱性模型3個遺傳模型下PPARG基因的中rs1801282，rs1899951，rs2881654，rs2921190，rs2959272，rs1875796，rs4135275，rs1151999位點變異可能與柯爾克孜族人T2DM相關(guān)，GAACGAA單體型可能是柯爾克孜族T2DM的遺傳標記.為今后對新疆柯爾克孜族2型DM遺傳學(xué)機制研究提供理論依據(jù)，同時進行的PPRAG基因23個等位基因的遺傳數(shù)據(jù)有利于探討柯爾克孜族與其他族群的遺傳結(jié)構(gòu)提供證據(jù).