高α-酸型馬可波羅啤酒花揮發(fā)性成分的研究?

劉玉梅，王利平，白珊珊，徐海寧

(1.新疆大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214000)

啤酒花被譽(yù)為“啤酒的靈魂”[1]，對啤酒的風(fēng)味起著至關(guān)重要的作用.按照啤酒花的α-酸含量及其用途不同，國際上通常將啤酒花分為優(yōu)質(zhì)香型花、香型花、苦型花和高酸型花等幾大類[2].業(yè)界普遍認(rèn)為，香型啤酒花是賦予啤酒特殊的酒花香氣的關(guān)鍵因素[3]，因此，對香型啤酒花的風(fēng)味成分及其在啤酒中的含量變化研究較多[4?6]，而苦型啤酒花的添加主要是提供了啤酒獨(dú)特的苦味和防腐作用，對其風(fēng)味成分的研究關(guān)注較少.由于在啤酒釀造過程中，香型啤酒花通常在麥汁煮沸結(jié)束前幾分鐘添加，而苦型啤酒花則常在麥汁煮沸的過程中添加，在啤酒中的利用率要明顯高于香型啤酒花[7]，而我們近期的研究也表明，苦型啤酒花的品種和數(shù)量對最終啤酒的酒花風(fēng)味也會(huì)產(chǎn)生明顯的影響[8].中國盡管也是啤酒花的原產(chǎn)地之一，但啤酒花的品種（特別是在國際上具有競爭力的啤酒花品種）相對較少.馬可波羅啤酒花是新疆引種培育的一個(gè)高α-酸的啤酒花新品種，因產(chǎn)量高，加工性能好，近年來種植面積逐漸擴(kuò)大.本研究以馬可波羅啤酒花為研究對象，采用HS-SPME-GC-MS分析方法，以質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索和保留指數(shù)（Kovats retention indices RI）計(jì)算相結(jié)合的方法進(jìn)行定性，用面積歸一化來定量，對馬可波羅顆粒啤酒花、啤酒花浸膏，分子蒸餾精油和水蒸氣蒸餾的精油的主要成分的組成和含量信息進(jìn)行了比較性研究，以期能為啤酒廠的生產(chǎn)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

馬可波羅啤酒花：由新疆三寶樂農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司提供；C6-C26正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品：購于Sigmaaldrich公司.

1.2 儀器設(shè)備

Finnigan Trace MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；手動(dòng)SPME進(jìn)樣器，100μmPDMS萃取頭，美國SUPELCO公司產(chǎn)品；MD-S80分子蒸餾裝置，廣州漢維機(jī)電有限公司；121-50-2型超臨界萃取裝置，江蘇華安南通超臨界CO2萃取有限公司；實(shí)驗(yàn)室水蒸氣蒸餾裝置

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

馬可波羅顆粒啤酒花：馬可波羅啤酒花顆粒經(jīng)脫氣充氮包裝處理后，在-2?C以下儲藏，使用前取出粉碎.

馬可波羅水蒸氣蒸餾酒花油：將上述顆粒啤酒花粉碎后置于試驗(yàn)室自制的水蒸氣蒸餾裝置中進(jìn)行蒸餾，得到馬可波羅啤酒花的水蒸氣蒸餾樣品.

馬可波羅啤酒花浸膏：采用超臨界CO2萃取的方法，將前述顆粒啤酒花粉碎后放入超臨界CO2萃取的萃取釜中，控制萃取溫度45?C，萃取壓力25 MPa，分離溫度65?C，分離壓力6 MPa，CO2流速20L/h，循環(huán)萃取2h，得到馬可波羅啤酒花浸膏樣品.

分子蒸餾啤酒花油：將上述步驟獲得的馬可波羅啤酒花浸膏樣品于60?C水浴中預(yù)先融化后，置于MDS80的分子蒸餾裝置的貯料罐中，打開系統(tǒng)真空系統(tǒng)，控制體系真空度在2～3Pa，蒸餾溫度65?C的條件下，以500 mL/h的物料流速進(jìn)行蒸餾1h，得到分子蒸餾馬可波羅啤酒花油樣品.

1.3.2 分析條件

色譜柱：PEG20M毛細(xì)管色譜柱，30 m×0.25 mm×0.25μm；檢索譜庫：NIST2005、Wiley7.0；色譜條件：起始柱溫35?C，保留2 min，以8?C/min速度升溫至100?C，然后再以6?C/min的速度升溫至230?C，保留6 min，載氣He，不分流進(jìn)樣，恒流0.8 mL/min，進(jìn)樣口溫度250?C，接口溫度250?C；質(zhì)譜條件：離子源溫度200?C，電離方式EI+，電子能量70 eV，發(fā)射電流200μA，檢測器電壓350V，掃描質(zhì)量范圍33～453 amu.

采用靜態(tài)頂空固相微萃取法：取0.2 g上述各種啤酒花樣品放入6 mL頂空瓶中，于50?C的水浴中用已老化至無雜質(zhì)峰的萃取頭吸附40 min，然后進(jìn)GC-MS分析.

1.3.3 定性定量分析

通過譜庫檢索、保留指數(shù)RI的計(jì)算值與文獻(xiàn)值[9,10]進(jìn)行比對，對成分進(jìn)行定性，定量采用峰面積歸一化來計(jì)算.保留指數(shù)計(jì)算如下：

其中TR(x)，TR(z)，TR(z+1)分別為被分析組分和碳原子數(shù)處于Z和Z+1之間的正構(gòu)烷烴的流出峰的調(diào)整保留時(shí)間(min).

2 結(jié)果分析

啤酒花采收后由于水分含量高，不易儲存，需將其烘干、壓縮、打包后冷藏存放，在釀造啤酒時(shí)粉碎后直接加入麥汁煮沸鍋中.由于壓縮啤酒花體積較大，儲存不便，而且儲存過程中活性成分損失較快，釀酒過程的利用率也較低.因此，近20多年來，為了提高啤酒花的儲藏品質(zhì)，也為了減少存放空間，通常在不添加任何添加劑的條件下將干燥的啤酒花粉碎后壓制成長15 mm、直徑6 mm左右的短棒狀，然后進(jìn)行真空充氮包裝，這就是所謂的“顆粒啤酒花”.啤酒花顆粒在成分上與啤酒花一致，完全保持了其特有的風(fēng)味特征，在儲存和使用上都比壓縮啤酒花更為方便，但并未從根本上解決其利用率低的問題.目前，采用超臨界CO2萃取技術(shù)獲得的啤酒花浸膏，因能基本上保持啤酒花的主要特征風(fēng)味已在國內(nèi)外啤酒廠中大量使用.由于啤酒花浸膏不但可以節(jié)省儲存空間，在長期的保存過程中活性成分也比較穩(wěn)定，在一定程度上還可以緩解由于啤酒花產(chǎn)量過剩而給農(nóng)民帶來的損失.馬可波羅啤酒花是近年來新培育的高酸型苦型花品種，為了考察加工過程對啤酒花揮發(fā)性成分的影響，也為了給啤酒生產(chǎn)廠家提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參考，本實(shí)驗(yàn)采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法（HS-SPME-GC-MS），在分析了啤酒花顆粒的揮發(fā)性成分基礎(chǔ)上，比較了在加工過程中，不同的加工工藝對馬可波羅啤酒花揮發(fā)性成分所產(chǎn)生的影響.圖1為馬可波羅顆粒啤酒花樣品的總離子流圖.

圖1 馬可波羅啤酒花代表性樣品的總離子流圖（顆粒啤酒花）

為了保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的一致性，文中采用同一批次生產(chǎn)的啤酒花來完成實(shí)驗(yàn)，采用頂空固相微萃取的方法不僅分析速度和檢測靈敏度高[11,12]，而且也保證了對樣品中揮發(fā)性成分的前處理過程的一致性.由于啤酒花揮發(fā)性成分以萜烯和倍半萜烯類物質(zhì)為主，存在很多結(jié)構(gòu)相近的同分異構(gòu)體，這類化合物的質(zhì)譜碎片相似，僅以質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫定性尚不夠準(zhǔn)確.為了使得定性結(jié)果更為可靠，本實(shí)驗(yàn)采用C6-C26的正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品做對照，對分離的色譜峰保留指數(shù)進(jìn)行計(jì)算，并通過與同類型色譜柱所查閱的文獻(xiàn)值進(jìn)行比較，最終確定樣品中的各組分組成信息.文獻(xiàn)中記載的保留指數(shù)與本實(shí)驗(yàn)中所采用的色譜柱及升溫程序并非完全一致，故文中檢索到的部分樣品的保留指數(shù)與文獻(xiàn)值并不完全一致，僅可作為定性的參考.

表1為HP-SPME-GC-MS分析馬可波羅啤酒花的結(jié)果，其中二氧化碳浸膏、分子蒸餾精油和水蒸氣蒸餾精油僅列出顆粒酒花中存在的共有組分.

表1 HP-SPME-GC-MS分析馬可波羅啤酒花的揮發(fā)性成分及其提取物中共有組分

表1 續(xù)HP-SPME-GC-MS分析馬可波羅啤酒花的揮發(fā)性成分及其提取物中共有組分

表1 續(xù)HP-SPME-GC-MS分析馬可波羅啤酒花的揮發(fā)性成分及其提取物中共有組分

由表1的數(shù)據(jù)可知，馬可波羅顆粒啤酒花共鑒定出96個(gè)組分，占總峰面積的99.25%，其主要揮發(fā)性成分是以2-β-蒎烯、β-香葉烯、d-檸檬烯、β-羅勒烯、1,3,8-對薄荷三烯、古巴烯、β-石竹烯、α-葎草烯、δ-杜松烯、依蘭油烯、γ-杜松烯、α-蛇床烯、β-蛇床烯、3,7(11)-桉葉二烯、1S,cis-菖蒲萜烯等為代表的萜烯類化合物和以丙酮、里哪醇、α-桉葉油醇、4-癸烯酸甲酯、乙酸香葉酯等為代表的含氧化合物，主要化合物組成為碳?xì)漕惢衔铩⒅?、醇類、以及少量的醛、酮、酸類和萜烯類氧化?與顆粒酒花相比，馬可波羅酒花浸膏中的共有組分峰面積為96.94%，分子蒸餾的酒花精油中共有組分的總峰面積為92.03%，而水蒸氣蒸餾的酒花精油中的共有峰的峰面積僅為81.81%.說明在加工過程中，啤酒花的風(fēng)味發(fā)生了一定的變化，特別是水蒸氣蒸餾的啤酒花精油，由于較長時(shí)間的高溫作用，其中的成分發(fā)生了比較明顯的轉(zhuǎn)變[14].表1中的數(shù)據(jù)還可以看出，不僅總的峰面積發(fā)生的變化，共有組分的組成成分和含量也發(fā)生了較大的變化.四種啤酒花樣品中的共有揮發(fā)性成分的組成及含量見表2.

表2 四種啤酒花樣品中的共有揮發(fā)性組分的比較

表2的數(shù)據(jù)表明，與顆粒啤酒花相比，CO2浸膏的揮發(fā)性成分與其最為接近.結(jié)合表1的數(shù)據(jù)可以看出，盡管兩者在碳?xì)浠衔锏目偤?、醛酮、醇類、酯類化合物等的組成上都非常相似，但碳?xì)浠衔锏慕M成與醛酮、醇類、酯類化合物的含量上還是發(fā)生了一定的變化.以酒花中主要的萜烯類物質(zhì)的含量變化來看，在CO2浸膏的提取過程中，分子量相對較小、低沸點(diǎn)的香葉烯在加工過程中大量損失，相對含量從31.33%下降到了14.02%，同樣，進(jìn)一步采用分子蒸餾提取的酒花精油所獲得的數(shù)據(jù)也證實(shí)了這一結(jié)論，其在酒花油中的相對含量僅為2.0%.而分子量相對較大、沸點(diǎn)較高的葎草烯和石竹烯，在提取CO2浸膏的過程中由于損失較小，被進(jìn)一步富集，相對含量分別從12.31%和9.5%提高到了20.61%和16.13%，但葎草烯與石竹烯的比值基本保持不變，該比值也是評價(jià)啤酒花香氣的一個(gè)重要指標(biāo).進(jìn)一步的分子蒸餾提取精油過程中，葎草烯與石竹烯相對含量也基本保持穩(wěn)定，分別為18.21%和16.52%.對比顆粒酒花與CO2浸膏的化合物組成顯示，在加工過程中，顆粒酒花中存在的很多沸點(diǎn)相對較低的組分，在加工過程中損失較為明顯，如α-側(cè)柏烯、2-β-蒎烯、α-香葉烯、γ-萜品烯、別羅勒烯、新別羅勒烯、波斯菊萜等成分在CO2浸膏中已經(jīng)無法檢測到存在，相應(yīng)的分子蒸餾精油中也沒有檢測到這些化合物，而在顆粒酒花中相對含量較低或檢測不到的一些含氧化合物，如醇類、酯類和萜烯氧化物等的種類和含量都明顯提高，這一方面是由于低沸點(diǎn)組分的損失使得這些化合物在提取物中得以富集，另一方面也是由于加工過程中部分萜烯類化合物向萜烯醇轉(zhuǎn)化而引起的，如橙花醇，香茅醇等在顆粒酒花中并不存在，而在加工產(chǎn)品中均檢測到了該組分，CO2浸膏中相對含量為0.3%，分子蒸餾精油中的相對含量為0.74%，這些物質(zhì)的產(chǎn)生對協(xié)調(diào)啤酒產(chǎn)品中的酒花香氣具有非常重要的作用.

水蒸氣蒸餾獲得的啤酒花油無論是組成成分還是相對含量上與前三個(gè)樣品均存在較大的差異.由于水蒸氣蒸餾酒花油的過程中需要在較高的溫度下處理一定的時(shí)間，這一個(gè)過程中，低沸點(diǎn)的揮發(fā)性成分會(huì)大量損失，碳?xì)漕惢衔锏暮恳严陆档搅?7.86%，而醇、酯和萜烯類氧化物的比例大幅提高，分別達(dá)到了7.5%、11.03%和11.34%，這些成分很多在顆粒酒花中檢測不到或僅有微量存在.比較水蒸氣蒸餾的酒花油與顆粒酒花的揮發(fā)性成分的數(shù)據(jù)表明，水蒸氣蒸餾酒花油中β-香葉烯含量僅為顆粒酒花中的43%，其它一些在顆粒酒花中含量較高的羅勒烯、蒎烯、萜品烯、1，3，8-對薄荷三烯、別羅勒烯、檸檬烯等檢測不到或含量明顯下降，而香葉醇（0.37%）、橙花醇(56%)、萜品烯醇(0.35%)、羅勒醇(0.47%)、香茅醇(0.17%)、芳樟醇(0.66%)、紫蘇醇（0.27%）、金合歡醇杜松醇（0.90%）、桉葉油醇（0.69%）等物質(zhì)從無到有或者含量明顯提高，都說明了在水蒸汽的作用下酒花中的一些萜烯類物質(zhì)發(fā)生了結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化或氧化為其醇類[15].

3 結(jié)論

早期研究中人們普遍認(rèn)為，萜烯類物質(zhì)對啤酒的酒花風(fēng)味發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，但近年來的研究發(fā)現(xiàn)，親水性較強(qiáng)的萜烯醇類對啤酒風(fēng)味的貢獻(xiàn)更為明顯[16].通過比較馬可波羅啤酒花的顆粒酒花及其深加工產(chǎn)品馬可波羅CO2浸膏、分子蒸餾的酒花精油、水蒸氣蒸餾的酒花精油的揮發(fā)性成分的結(jié)果表明，啤酒花揮發(fā)性成分以萜烯類化合物為主，其中CO2浸膏因加工工藝條件溫和，與顆粒酒花的共有組分?jǐn)?shù)量最多（達(dá)78個(gè)），組成也最為接近，除加工過程中低分子量的成分香葉烯等部分損失外，樣品中僅有相對含量約2.5%的其它化合物出現(xiàn)，比較完整的保留了酒花的特征風(fēng)味.而通過分子蒸餾獲得的啤酒花精油，由于加工過程溫度也相對較為溫和，且物料與熱源接觸時(shí)間短，除由于分子蒸餾的工藝特點(diǎn)導(dǎo)致的低沸點(diǎn)物質(zhì)損失和短暫高溫引起的含氧化合物如醇、醛、酮、酯和氧化物的數(shù)量明顯多于CO2浸膏外，保留下來的組分基本與CO2浸膏中的共有組分含量比例極為接近，不僅萜烯類化合物的總量接近76%，與顆粒酒花相比共有組分的相對比例也達(dá)到了92%.而水蒸汽蒸餾酒花油由于溫度高，提取時(shí)間長，已不能完全反映出啤酒花本身的風(fēng)味特征，不僅低沸點(diǎn)的頭香類組分損失較多，共有組分的數(shù)量也較少（僅有56個(gè)），且含量變化也較大，但水蒸氣蒸餾提取啤酒花油的過程比較接近啤酒釀造的麥汁煮沸過程，更能反映出在啤酒釀造過程中啤酒花風(fēng)味成分的轉(zhuǎn)化或氧化轉(zhuǎn)變的途徑.