冠心止痛膠囊含藥血清對過氧化氫損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的保護作用*

梁瑞峰　王守富　宋獻美

（1.河南省中醫(yī)藥研究院，河南鄭州450004；2.河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，河南鄭州450004；3.河南醫(yī)學高等?？茖W校，河南鄭州451191）

·研究報告·

冠心止痛膠囊含藥血清對過氧化氫損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的保護作用*

梁瑞峰1王守富2△宋獻美3

（1.河南省中醫(yī)藥研究院，河南鄭州450004；2.河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，河南鄭州450004；3.河南醫(yī)學高等?？茖W校，河南鄭州451191）

目的觀察冠心止痛膠囊含藥血清對過氧化氫（H2O2）誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）損傷的保護作用。方法體外培養(yǎng)HUVEC，分為空白對照組、模型對照組、冠心止痛膠囊含藥血清低、中、高濃度組（體積分數(shù)為5.00%、10.00%、15.00%），顯微鏡觀察細胞形態(tài)；MTT法檢測細胞活力，微板法檢測上清液中乳酸脫氫酶（LDH）的活性及一氧化氮（NO）的含量，ELISA法檢測內(nèi)皮素-1（ET-1）、組織型纖溶酶原激活物（tPA）、纖溶酶原激活物抑制劑（PAI-1）的含量。結(jié)果與模型對照組比較，冠心止痛膠囊中、高濃度組細胞活力顯著升高，LDH活性顯著減低、ET-1和PAI-1含量顯著減少，NO和tPA顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論冠心止痛膠囊含藥血清對H2O2誘導的HUVEC損傷具有顯著地保護作用。

冠心止痛膠囊含藥血清人臍靜脈內(nèi)皮細胞過氧化氫

冠心病是常見的心血管疾病，其病理基礎(chǔ)是冠狀動脈發(fā)生不同程度的粥樣硬化直至血管閉塞，發(fā)病因素之一是血管內(nèi)皮功能障礙。血管內(nèi)皮作為組織和血液間的屏障，具有多種生物學功能，其分泌的生物活性物質(zhì)具有維持血管張力、調(diào)節(jié)血壓、抗血栓形成等作用。內(nèi)皮細胞損傷是心血管疾病發(fā)病的關(guān)鍵因素［1］。氧化應(yīng)激被認為在內(nèi)皮細胞損傷中起關(guān)鍵作用，因而抗氧化應(yīng)激對于心血管疾病的治療具有重要意義［2］。冠心止痛膠囊是河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，由瓜蔞、半夏、紅花、赤芍、蒲黃、川芎、紫蘇梗等組成，主要用于痰瘀交阻型冠心病心絞痛的治療，臨床療效確切。為闡明冠心止痛膠囊的作用機制，本研究采用冠心止痛膠囊含藥血清干預H2O2誘導損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細胞，以探討該藥保護血管內(nèi)皮損傷的作用及機制，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物及細胞SPF級SD大鼠，雄性，40只，體質(zhì)量180～200 g，購于河南省實驗動物中心，許可證號SCXK（豫）2010-0002。人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC），購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2試藥與儀器冠心止痛膠囊（河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院制劑室提供，批準文號：豫藥制字Z20121056，批號20130301）；胎牛血清、1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購自Hyclone公司；噻唑藍（MTT，Amresco公司）；H2O2（國藥集團化學試劑有限公司）；乳酸脫氫酶（LDH）、一氧化氮（NO）試劑盒購自南京建成生物公司；內(nèi)皮素-1（ET-1）、組織型纖溶酶原激活物（tPA）、纖溶酶原激活物抑制劑（PAI-1）試劑盒均購自武漢華美生物工程有限公司；Synergy NEO型全功能酶標儀（Bio-Tek公司）；3164型細胞培養(yǎng)箱（Forma Scientific公司）；2K15型冷凍離心機（Sigma公司）；XSJ-D型倒置相差顯微鏡（重慶光學儀器廠）。

1.3含藥血清制備40只SD大鼠隨機分為空白對照組和冠心止痛膠囊組，每組20只。按體表面積法換算動物的等效劑量，冠心止痛膠囊組給予冠心止痛膠囊3.00 g/（kg·d）（等效劑量的5倍），空白對照組給予蒸餾水，灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7 d，末次給藥后2 h，麻醉腹主動脈取血，3000 r/min離心10 min分離血清，56℃水浴滅活30 min，0.22 μm過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4細胞培養(yǎng)及分組用含10.00%胎牛血清的1640培養(yǎng)液于37℃，5.00%CO2條件下培養(yǎng)HUVEC，待細胞至80.00%融合時，加入0.25%胰酶消化，吹打，制成細胞懸液，接種于48或96孔板。實驗設(shè)空白對照組（體積分數(shù)為15%的空白血清）、模型對照組（15.00%空白血清+200 μmol/L H2O2）、冠心止痛膠囊低濃度組（5%冠心止痛膠囊血清+10%空白血清+200 μmol/L H2O2）、中濃度組（10%冠心止痛膠囊含藥血清+5%空白血清+200 μmol/L H2O2）及高濃度組（15.00%冠心止痛膠囊含藥血清+200μmol/L H2O2），每組均設(shè)6個復孔［3］。

1.5細胞形態(tài)學觀察將HUVEC以1×105個/mL接種于96孔板培養(yǎng)24 h后，分組干預處理，藥物孵育24 h后，倒置顯微鏡下觀察HUVEC形態(tài)改變。

1.6MTT法測定細胞活力將HUVEC以1×105個/mL接種于96孔板，另設(shè)6孔為陰性組（無細胞），培養(yǎng)24 h后，分組處理孵育20 h后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h，小心吸棄培養(yǎng)液，然后每孔加入150 μL DMSO，避光震蕩10 min，用酶標儀于570 nm處測定各孔的吸光度（A）并計算細胞存活率。細胞存活率=（實驗組A-陰性組A）/（空白組A-陰性組A）× 100%。

1.7培養(yǎng)液中LDH、NO、ET-1測定細胞以1×105個/mL接種于48孔板培養(yǎng)24 h后，分組藥物孵育24 h后，收集上清液，采用微板法檢測各組細胞上清液中LDH的活性和NO的含量，ELISA法檢測各組上清液中ET-1、tPA、PAI-1的含量。

1.8統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1冠心止痛膠囊含藥血清對細胞形態(tài)學的影響見圖1。顯微鏡下觀察，空白對照組HUVEC排列緊密，生長狀態(tài)良好，細胞呈梭形或多角形，大小均勻，邊界清楚，呈單層鋪路石樣排列。模型對照組細胞皺縮變圓，大小分布不均，間隙增大，細胞排列紊亂，并形成大片脫失區(qū)，失去典型的鋪路石樣形狀。與模型對照組比較，冠心止痛膠囊低濃度組細胞形態(tài)無明顯變化，但細胞間隙較小，邊界較清，少數(shù)細胞呈梭形。冠心止痛膠囊中、高濃度組細胞形態(tài)明顯改善，可見大部分細胞呈梭形或多角形，細胞間隙小，細胞間連接較為緊密，呈單層排列。

2.2冠心止痛膠囊含藥血清對各組細胞活力的影響見表1。結(jié)果示與空白對照組相比，H2O2損傷后HUVECs存活率顯著降低（P＜0.01）；與模型對照組相比，冠心止痛膠囊中、高濃度組細胞活力顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

圖1　顯微鏡下各組細胞形態(tài)（100倍）

acids contribute with altered nitric oxide and endothelin-1 pathways to conduit artery endothelial dysfunction in essential hypertension［J］.Circulation，2012，125（10）：1266-1275.

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·證治探討·

表1　各組細胞活力比較（±s）

表1　各組細胞活力比較（±s）

與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組別nA值細胞存活率（%）空白對照組60.579±0.093100±9.21模型對照組60.220±0.04437.98±7.60冠心止痛低濃度組60.267±0.05246.11±8.98冠心止痛中濃度組60.414±0.053*71.50±9.15*冠心止痛高濃度組60.508±0.037**87.74±6.39**

2.3冠心止痛膠囊含藥血清對各組細胞LDH、NO、ET-1、tPA、PAI-1的影響見表2。結(jié)果示與模型對照組相比，冠心止痛膠囊中、高濃度組上清液中LDH活性、ET-1含量降低，tPA的分泌增加（P＜0.05或P＜0.01），冠心止痛膠囊高濃度組上清液NO含量顯著升高，PAI-1的分泌顯著減少（P＜0.01）。

表2　各組細胞LDH、NO、ET-1、tPA、PAI-1水平比較（±s）

表2　各組細胞LDH、NO、ET-1、tPA、PAI-1水平比較（±s）

組別n空白對照組6模型對照組6冠心止痛低濃度組6 LDH（U/L）NO（μmol/L）ET-1（pg/mL）603.29±69.0252.69±4.2846.22±7.70 946.71±120.6530.76±2.8372.81±13.84 877.63±77.8632.96±2.1465.94±11.46 tPA（ng/mL）PAI-1（ng/mL）58.39±8.2243.03±8.73 43.58±5.7477.57±7.78 49.74±5.3378.45±10.99冠心止痛中濃度組6730.92±61.39**40.39±3.49**58.39±9.48*53.57±5.49*66.35±17.07冠心止痛高濃度組6671.05±65.56**48.76±2.75**48.43±7.34**56.68±6.01**48.96±11.59**

3　討論

血管內(nèi)皮具有生成、激活和釋放多種生物活性物質(zhì)的功能，參與血液循環(huán)，起著調(diào)節(jié)血管張力、防止血栓形成等眾多保護作用。近年研究表明，氧化應(yīng)激誘導的血管內(nèi)皮細胞凋亡在心血管疾病的發(fā)病機制中具有重要作用。消除過多的活性氧自由基與抑制細胞凋亡可對治療心血管疾病提供有益的干預［4-5］。H2O2作為活性氧之一，可分解成氧自由基，在細胞外誘導細胞凋亡，同時促進細胞內(nèi)羥自由基的產(chǎn)生，誘導細胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，引起細胞受損而死亡，因此，本實驗以H2O2為刺激因素造成細胞損傷模型［6］。MTT實驗是一種檢測細胞存活和生長的方法，可以反映活細胞的數(shù)量。本實驗結(jié)果表明，H2O2可誘導HUVEC凋亡，而冠心止痛膠囊含藥血清具有抗H2O2誘導的內(nèi)皮細胞損傷的作用。

LDH是胞內(nèi)酶，漏出量的多少反映細胞膜的完整性和細胞的損傷程度。ET-1是內(nèi)皮細胞釋放的強效血管收縮因子，與血管舒張因子NO組成維持正常內(nèi)皮功能的一對拮抗因子，生理情況下二者相互平衡，病理狀態(tài)下這種平衡一旦被打破，即出現(xiàn)內(nèi)皮功能障礙，進而導致血管病變［7-8］，糾正兩者的失衡有利于改善血管內(nèi)皮功能。本研究顯示H2O2可導致HUVEC中LDH、ET-1含量增加，NO含量降低，表明H2O2引起內(nèi)皮細胞氧化損傷，冠心止痛膠囊含藥血清中、高濃度可抑制模型細胞LDH的漏出，減少ET-1的分泌，提高NO的含量，恢復ET-1與NO之間的平衡。

tPA、PAI-1是人體內(nèi)纖溶系統(tǒng)的重要組成部分，tPA是纖維蛋白溶解系統(tǒng)的重要組成部分，由血管內(nèi)皮細胞分泌，能夠轉(zhuǎn)化纖溶酶原成為具有催化作用的纖溶酶，主要由血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，PAI-1是tPA的主要生理性抑制劑，PAI-1與tPA 1∶1結(jié)合，快速將其滅活［9］。PAI-1與tPA之間的平衡決定著機體纖溶狀態(tài)。tPA含量降低，PAI-1含量升高會引起纖溶活性降低，機體凝血與溶血間平衡失調(diào)，使沉積于血管內(nèi)皮的纖維蛋白不易溶解，促進血栓形成［10］。大量研究表明，心腦血管疾病的重要特點之一就是tPA和PAI-1的平衡變化［11］。本實驗表明H2O2可導致內(nèi)皮細胞tPA分泌量減少，PAI-1分泌量增加，冠心止痛膠囊含藥血清中、高濃度可提高模型細胞tPA的分泌，降低PAI-1的分泌，改善tPA和PAI-1間的平衡。

綜上所述，冠心止痛膠囊含藥血清對活性氧所致血管內(nèi)皮細胞損傷具有保護作用，此作用與其降低細胞的脂質(zhì)過氧化程度密切、恢復ET-1與NO間的平衡、改善纖溶狀態(tài)有關(guān)。鑒于冠心止痛膠囊在血管內(nèi)皮上所具有的保護作用，提示其可能在防治高血壓等心血管疾病所伴隨的血管內(nèi)皮功能失調(diào)具有良好的應(yīng)用前景。

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Protective Effect of Medicated Serum Prepared with Guanxin Zhitong Capsule on Human Umbilical Vein Endothelial Cell Injured by Hydrogen Peroxide

LIANG Ruifeng，WANG Shoufu，SONG Xianmei.Research Institute of Traditional Chinese medicine in Henan Province，Henan，Zhengzhou 450004，China

Objective：To observe the protective effect of medicated serum prepared with Guanxin Zhitong Capsule on the injury of human umbilical veinendothelial cell（HUVEC）injured by hydrogen peroxide.Methods：The HUVEC were cultured vitro and divided into five groups as follows：the control group，the model group，the low-dosage of Guanxin Zhitong Capsule group，the mid-dosage of Guanxin Zhitong Capsule group and the highdosage of Guanxin Zhitong Capsule group（volume fraction was 5%，10%，15%）.Cell morphology was observed under inverted phase contrast microscope.MTT was used to determine the HUVEC viability.The contents of lactate dehydrogenase（LDH），nitric oxide（NO）were measured with the microplate and the method of enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was used to determine endothelin-1（ET-1），tissue plasminogen activator（tPA）and plasminogen activator inhibitor-1（PAI-1）.Results：Compared with the model group，the mid-dosage of Guanxin Zhitong Capsule and high-dosage of Guanxin Zhitong Capsule significantly increased HUVECs viability，decreased the contents of LDH，ET-1，PAI-1 and increased the contents of NO and tPA（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：Medicated serum prepared with Guanxin Zhitong Capsule has significant protective effect on HUVEC injured by H2O2.

Guanxin Zhitong Capsule；Medicated serum；HUVEC；Hydrogen peroxide

R285.6

A

1004-745X（2015）11-1885-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.11.002

2015-03-09）

國家中醫(yī)藥管理局重點學科建設(shè)項目（國中醫(yī)藥發(fā)［2009］30號）；國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)心病學重點學科基礎(chǔ)研究課題（1304483）

（電子郵箱：shoufuwang@126.com）