補腎活血化痰方對腦出血大鼠腦組織MMP-9表達及血清NSE的影響*

侯斌　張樹泉　陳再林

（1.山東省泰安市中醫(yī)醫(yī)院，山東泰安271000；2.湖南省瀏陽市中醫(yī)醫(yī)院，湖南瀏陽410300）

·研究報告·

補腎活血化痰方對腦出血大鼠腦組織MMP-9表達及血清NSE的影響*

侯斌1張樹泉1陳再林2

（1.山東省泰安市中醫(yī)醫(yī)院，山東泰安271000；2.湖南省瀏陽市中醫(yī)醫(yī)院，湖南瀏陽410300）

目的觀察補腎活血化痰方對大鼠腦出血后腦組織基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達及血清神經元特異性烯醇化酶（NSE）的影響。方法采用自體不凝血注入尾狀核法制備腦出血模型。將大鼠隨機分為假手術組、模型組、補腎活血化痰方組，假手術組和模型組每日給予生理鹽水灌胃，補腎活血化痰方組給予補腎活血化痰方煎劑。各組分別在腦出血術后24、48、72、120 h各個時點取血，留取腦組織標本。于各時點觀測大鼠腦含水量，用免疫組化法檢測大鼠腦組織MMP-9的表達水平，用酶聯免疫吸附法測定血清中NSE的含量。結果補腎活血化痰方組各時點腦含水量明顯低于模型組（P＜0．05），各時點腦組織MMP-9陽性表達較模型組明顯減少（P＜0．01），血清NSE水平在48、72、120 h時較模型組顯著降低（P＜0．01）。結論補腎活血化痰方能減輕腦水腫，減輕腦組織損傷，其作用可能和有效抑制腦出血大鼠腦組織MMP-9表達，降低血清NSE水平有關。

補腎活血化痰方腦出血基質金屬蛋白酶-9神經元特異性烯醇化酶

腦出血后的腦水腫導致腦組織損傷和神經功能改變，顱內壓增高嚴重時可以形成腦疝，這是腦出血高死亡率、高致殘率的重要原因。近年研究表明，基質金屬蛋白酶（MMPs）參與了血腦屏障的損害過程，其中MMP-9在血腦屏障的破壞過程中發(fā)揮重要作用，與腦出血及腦水腫關系密切［1］。神經元特異性烯醇化酶（NSE）是存在于神經元和神經內分泌細胞中的烯醇化酶，NSE升高標志神經元損傷。前期研究證實，補腎活血化痰方治療急性期出血療效肯定［2］，但機制尚不完全清楚。為了進一步探討補腎活血化痰方治療急性期腦出血的可能作用機制，筆者復制了急性期腦出血大鼠模型，就補腎活血化痰方對大鼠腦出血后腦組織MMP-9表達及血清NSE的影響進行研究，為其臨床應用提供實驗依據?，F報告如下。

1　材料與方法

1.1動物及分組選取健康、成年SD雄性大鼠96只，由山東省泰山醫(yī)學院實驗動物中心提供，體質量250～300 g，飼以標準飼料，自由飲水，20～25℃環(huán)境飼養(yǎng)。將其隨機分為假手術組、模型組和補腎活血化痰方組，每組各32只。

1.2試劑及儀器MMP-9免疫組化檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），NSE試劑盒（上海拜力生物科技有限公司）；立體定位儀（華北生物儀器設備有限公司）；JY3002型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；MIAS醫(yī)學圖象分析系統(tǒng)（北航公司）。

1.3模型制備采用自體血注入尾狀核法建立大鼠腦出血模型。大鼠術前8h禁食，4h禁水，10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉。將大鼠俯臥固定于立體定向儀上，門齒溝水平比耳間線低2.4 mm；頭頂常規(guī)備皮，消毒，正中切口10 mm，沿矢狀縫切開頭皮，使前囟及冠狀縫暴露，參照Rosenberg等［3］方法，于前囟前0.5mm，中線右側旁開3 mm，用牙科鉆鉆一直徑約3 mm的圓孔，深度達硬腦膜表面，不傷及腦組織。用1 mL注射器經右側股動脈導管針抽取新鮮自體血100 μL，用微量注射泵將40 μL自體血經注血針緩慢注入到右側尾狀核內，注血完畢后，原位留針20 min，緩慢拔針，縫合皮膚，麻醉蘇醒后出現神經功能缺損癥狀視為造模成功。假手術組僅用空針穿刺，但不注血，留針時間相同。

1.4給藥方法補腎活血化痰方由制首烏、山茱萸、山藥、麥冬、五味子、菖蒲、郁金、茯苓、三七、當歸、川芎、丹參、益母草等組成，煎制、濃縮至每毫升含生藥1.1 g（由山東省泰安市中醫(yī)醫(yī)院制劑室制備）。補腎活血化痰方組予中藥液1.2 mL/100 g，模型組和假手術組予等量生理鹽水。造模成功后3 h開始給藥，每日灌胃1次，直至24、48、72、120 h各時點處死取材。

1.5標本采集及檢測各組分別在腦出血術后24、48、72、120 h各個時點處死8只，留取標本。1）腦組織含水量。乙醚麻醉后，迅速斷頭取腦，距離針道前后1.5 mm冠狀切取腦組織。取血腫邊緣部分腦組織0.2 g左右，控制在5 min內完成，將標本放于100℃烘箱中烘干24 h至恒質量，再稱干質量。按Billiot公式計算腦組織含水量：腦組織含水量=（濕質量-干質量）/濕質量×100%。以ng/mg表示腦組織濕質量。2）免疫組化SABC法檢測腦組織MMP-9的表達水平。以針眼為中心取血腫周邊腦組織約200 mg，常規(guī)脫水，石蠟切片60℃脫蠟過夜；二甲苯、梯度乙醇脫蠟，蒸餾水沖洗，3%雙氧水37℃浸泡消除過氧化物酶，PBS沖洗，抗原熱修復，滴加兔抗鼠MMP-9抗體，孵育2 h，沖洗，滴加生物素標記羊抗兔二抗，放置濕盒中，沖洗，孵育，DAB顯色，洗滌，蘇木素輕度復染，鹽酸酒精分化中性樹脂封片，顯微鏡觀察，照片，留存。所有圖像結果用計算機MIAS醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)檢測。切片于光鏡下400倍放大，隨機選取5個視野，測定MMP-9的陽性表達面積即目標面積與總統(tǒng)計場面積的比值即面密度（%）。陽性結果判斷：細胞膜或胞漿著色呈棕黃色。3）血清NSE水平檢測。在相應時間點末次給藥30 min后，10%水合氯醛腹腔麻醉，用注射器經右側股動脈導管針抽取新鮮血4 mL送實驗室，應用酶聯免疫吸附（ELISA）法對NSE水平進行測定。

1.6統(tǒng)計學處理采用SPSS18.0醫(yī)學統(tǒng)計學軟件處理，統(tǒng)計結果以（±s）表示，應用單因素方差分析，組間比較用SNK（Student-Newman-Keuls）法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠腦含水量的變化見表1。結果表明，假手術組個時間點腦含水量無顯著差異（P＞0.05），表明假手術組大鼠未出現腦水腫。模型組和補腎活血化痰方組腦含水量在各時點均較假手術組增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），在72 h時達到高峰。補腎活血化痰方組與模型組相比較，腦含水含量明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結果表明補腎活血化痰方針對腦出血后減少腦水腫含量作用顯著。

表1　各組腦出血后不同時間點大鼠腦含水量比較（%，±s）

表1　各組腦出血后不同時間點大鼠腦含水量比較（%，±s）

與假手術組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別n 24 h48 h72 h120 h假手術組8模型組8 71.08±0.9771.32±1.5970.93±1.3270.21±1.21 77.12±1.09*79.39±2.01*81.71±1.09*75.57±1.69*補腎活血化痰方組874.11±1.16*△76.39±1.07*△77.68±0.92*△71.78±1.52*△

圖1　MMP-9免疫組化染色（400倍）

2.2各組腦出血后大鼠腦組織MMP-9的表達比較見圖1，表2。免疫組化染色結果顯示，假手術組各時點見極少量MMP-9陽性表達；模型組、補腎活血化痰方組大鼠腦組織均可見染成棕黃色的MMP-9陽性表達信號，以胞質內為主，細胞間質也可見少量陽性表達，72 h時達高峰，染色強度加深，呈深棕色，120 h時表達回落，與假手術組相比，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；而與模型組比較，補腎活血化痰方組在各時點MMP-9陽性染色面積/總統(tǒng)計場面積，即面密度均明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），至72 h時陽性細胞表達相差最為明顯。

表2　各組腦出血后不同時間點大鼠腦組織MMP-9表達比較（%，±s）

表2　各組腦出血后不同時間點大鼠腦組織MMP-9表達比較（%，±s）

組別n 24 h48 h72 h120 h假手術組8模型組8 10.01±0.8710.97±1.0910.39±1.7710.26±1.35 68.12±2.59*78.39±1.51*85.27±3.16*58.19±2.01*補腎活血化痰方組845.72±3.19*△51.37±2.07*△60.19±2.95*△39.61±2.76*△

2.3各組大鼠各時點血清NSE水平比較見表3。結果顯示，模型組和補腎活血化痰方組NSE水平在各時點均較假手術組增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。補腎活血化痰方組與模型組相比較，在24 h時血清NSE水平無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05），在48、72、120 h時明顯低于模型組，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01），結果表明補腎活血化痰方可降低血清NSE水平，針對腦出血后腦組織損傷的保護作用效果顯著。

表3　各組腦出血后不同時間點血清NSE水平比較（μg/L，±s）

表3　各組腦出血后不同時間點血清NSE水平比較（μg/L，±s）

組別n 24 h48 h72 h120 h假手術組8模型組8 5.57±1.025.61±1.525.59±1.375.72±1.26 18.05±2.19*20.76±1.37*25.17±3.81*21.78±2.06*補腎活血化痰方組817.32±1.76*15.18±2.59*△16.49±1.78*△15.72±1.97*△

3　討論

大量實驗表明，腦出血造成的神經功能障礙與腦水腫及繼發(fā)的腦組織損傷密切相關［4］。MMP-9是MMPs家族中分子量最大的明膠酶，與腦組織損傷關系最為密切［5］。MMP-9可降解ECM中的Ⅳ型膠原、V型膠原酶、纖黏蛋白、彈性蛋白、層黏素等，可破壞腦基底膜的完整性，導致血腦屏障破壞，為炎性細胞向腦組織浸潤提供條件，進一步加重腦組織水腫及神經細胞損傷，是判斷腦出血后血腫周圍腦水腫嚴重程度及預后的重要指標。

NSE是一種參與糖酵解烯醇化酶的亞型，主要存在于大腦神經元和神經內分泌細胞，當神經細胞損傷或壞死后NSE從損傷的神經細胞漏出，通過血腦屏障進入腦脊液和血液。其對神經元損害極為敏感，是神經元損害的標志酶［6］，可對神經元損傷進行定量評價。有報道表明，腦出血患者的臨床預后與血清NSE含量有直接而明顯的關系［7］。因此監(jiān)測NSE水平可以作為判斷腦組織損傷以及預后的指標。

中醫(yī)學認為，“腦為髓之?！薄澳I主骨生髓通腦”“瘀血不去新血不生”“痰瘀同源”。本院山東省名中醫(yī)張樹泉教授提出：絡破血溢，痰瘀阻竅，髓海損傷是出血性中風的病理核心。腦組織損傷是腎虛的物質基礎，血腫及其導致的缺血是血瘀的物質基礎，循環(huán)障礙及腦組織水腫是痰阻的物質基礎，其基本病機為腎虛血瘀痰阻。補腎活血化痰是出血性中風的基本治法［8］。補腎活血化痰方為治療基本方，具有補腎活血、化痰利水之功。前期臨床觀察治療急性期腦出血患者90例，能明顯促進急性期血腫吸收，減輕腦組織水腫，改神經功能缺損NIHSS評分，改善預后［2］。

本研究顯示，補腎活血化痰方組大鼠各時間點的腦組織含水量明顯低于模型組，并且MMP-9的表達水平均較模型組明顯下降，提示補腎活血化痰方抗腦出血后腦水腫的作用強，其機制可能與抑制MMP-9的表達從而減輕血腦屏障的破壞有關。同時，還觀察了腦出血后對血清NSE水平的影響，結果顯示補腎活血化痰方組大鼠48、72、120 h時的血清NSE水平明顯低于模型組，提示該方能減輕急性期腦出血大鼠的神經細胞損傷，從而有利于抑制腦水腫的形成，保護神經功能。因此，補腎活血化痰方對中藥治療腦出血提供了理論和實驗依據，但中藥治療腦出血的作用機制是多方面的，還需要進一步探討。

［1］許宏偉，楊期東，劉曉英，等.MMP-2/9與腦出血后腦水腫的關系探討［J］.中風與神經疾病雜志，2004，21（4）：295-297.

［2］張樹泉，徐西元，侯斌，等.補腎活血化痰方治療急性期腦出血臨床研究［J］.中國中醫(yī)急癥，2012，21（4）：529-531.

［3］Rosenberg GA，Mun-Bryce S，Wesley M，et al.Collagenaseinduced intracerebral hemorrhage in rats［J］.Stroke，1990，21（5）：801-807.

［4］Hua Y，Schallert T，Keep RF，et al.Bahavioral tests after intracerebral hemorrhage in the rat［J］.Stroke，2002，33：2478-2484.

［5］Rosell A，Cuadrado E，Ortega-Aznar A，et al.MMP-9 positive neutrophil infiltration is associated to blood-brain barrier breakdown and basal lamina typeⅣcollagen degradation during hemorrhagic transformation after human ischemic stroke［J］.Stroke，2008，39（4）：1121-1126.

［6］朱貴忠，楊進波.急性腦出血患者血清神經元特異性烯醇化酶含量的變化［J］.西部醫(yī)學，2010，22（7）：1278-1280.

［7］劉水云，李炳法，楊文東.高血壓腦出血患者血清NSE、MMPO水平變化及其臨床價值［J］.醫(yī)學檢驗與臨床，2012，23（1）：42-44.

［8］張樹泉，張長平，陳馬力.論補腎活血化痰是腦出血的重要治法［J］.中國中醫(yī)急癥，2012，21（3）：367-369.

The Effect of Bushen Huoxue Huatan Decoction on MMP-9 Expression and NSE in Serum in Rats with Intracerebral Hemorrhage

HOU Bin，ZHANG Shuquan，CHEN Zailin.Taian Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shandong，Taian 271000，China

Objective：To investigate the effect of Bushen Huoxue Huatan Decoction on MMP-9 expressions and NSE in serum in rats with intracerebral hemorrhage.Methods：Intracerebral hemorrhage（ICH）models were made with nonthrombogenic autologous blood injection method，and then the rats were randomly divided into 3 groups：the sham operation group，the model group and the Bushen Huoxue Huatan group.Rats in the sham operation group and the model group were given saline while rats in the Bushen Huoxue Huatan group were intragastrically administrated with Bushen Huoxue Huatan decotion every day.After cerebral hemorrhage 24 h，48 h，72 h and 120 h，cerebral water content was detected，and then brain was turned to detect the expression of MMP-9 with immunohistochemical method which was expressed around hematoma.NSE was detected with ELISA method.Results：Both cerebral water content and MMP-9 levels in Bushen Huoxue Huatan group at all the four time points were lower than those of the model group after ICH（P＜0.05，P＜0.01，respectively）.NSE concentration in serum was distinct lower than the model group at the time point of 48 h，72 h and 120 h after ICH（P＜0.01，respectively）.Conclusion：Bushen Huoxue Huatan Decoction may increase the expression of MMP-9 and reduce NSE concentration to protect the cerebral nerve of cerebral hemorrhage.

Bushen Huoxue Huatan Decoction；Intracerebral hemorrhage；MMP-9；NSE

R285.5

A

1004-745X（2015）09-1543-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.09.014

2015-05-09）

山東省泰安市科技發(fā)展計劃項目（20103063）